Determinação da estrutura tridimensional por difração de raios-X da Brazilian Klebisiella Carbapenemase- BKC-1

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Silva, Paola Jacque De Souza Nascimento Da [UNIFESP]
• Orientador(a): Oliveira, Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandao De [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300001gz9p
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Carbapenemases; Resistência Bacteriana; Cristalografia; Estrutura Tridimensional
• Palavras-chave em Inglês: Carbapenemases; Bacterial Resistance; Crystallography; Three-Dimensional Structure
• Link de acesso: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=7679776; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59736

A emergência e disseminação da resistência aos antimicrobianos são problemas de grande importância mundial, particularmente entre os patógenos de importância clínica, como os bacilos Gram negativos e membros da família Enterobacteriaceae, em especial a espécie Klebsiella pneumoniae. O principal mecanismo de resistência desses patógenos é a produção de β-lactamases, que são enzimas que degradam antimicrobianos contendo um anel β-lactâmico. Apesar de bem descrito o processo pela qual as β-lactamases de espectro estendido promovem a catálise dos antimicrobianos β-lactâmicos, o modo pela qual as carbapenemases degradam os carbapenens ainda não está completamente estabelecido. O principal objetivo do presente trabalho foi estudar a estrutura e os mecanismos de ação de uma nova carbapenemase da classe A de Ambler, a BKC-1, identificada em amostras clínicas de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenens, isoladas de dois hospitais da cidade de São Paulo. Métodos: Para se atingir o objetivo proposto utilizamos a enzima recombinante, o gene blaBKC-1 foi clonado e expresso em células de Escherichia coli BL21 (DE3) cultivadas a 20°C por 16 horas. As condições de extração e purificação da enzima recombinante foram otimizadas. Diferentes protocolos de choque osmótico para a extração da proteína do espaço periplasmático foram realizados, a fração proteica do conteúdo periplasmático foi tratada com solução de sulfato de amônio, 85% saturada, de forma remover alguns contaminantes e permitir a redução de volume do material a ser posteriormente tradado. A proteína recombinante pET-BKC1 foi purificada por cromatografia de interação hidrofóbica, troca iônica e exclusão molecular. A proteína purificada foi estocada em solução de 10mM Tris pH 8,0 à - 20ºC. Para os ensaios de cristalização empregou- se a técnica de difusão de vapor por sitting drop e após diversas tentativas, foram obtidos cristais únicos da BKC nativa, os quais foram submetidos à difração de raios-X. A mutagênese por PCR de extensão por sobreposição foi utilizada para avaliar a participação dos resíduos de aminoácidos mais conservados na atividade catalítica e no mecanismo de ação da enzima. Foram produzidos e sequenciados seis mutantes. O mutante pET-BKC-1-S92A foi expresso seguindo o mesmo protocolo de extração e purificação empregados para a BKC-WT. Foi efetuado diversos ensaios de co-cristalização para este mutante complexado com diferentes ligantes. Os melhores cristais foram selecionados e difratados por raios X xix no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, em Campinas-SP. Resultados: A estrutura 3D da BKC-1 apresentou similaridade às outras β-lactamases de classe A, sendo constituída por dois domínios. A ausência do resíduo Cys238 e a inserção do resíduo de aminoácido Tyr na região da alça (Ω loop) sugerem que um grau maior de flexibilidade desta proteína permite que ocorram mudanças conformacionais que podem explicar a atividade carbapenemase. Os conjuntos de dados obtidos a partir de cocristalização da proteína recombinante com a mutação no resíduo Ser92Ala complexada com benzilpenicilina apresentaram baixas densidades eletrônicas, enquanto que para os demais complexos, não foram observadas densidades eletrônicas que fossem características dessas substâncias.