Estudos biológicos e estruturais da BthaTL, uma serinopeptidase recombinante da peçonha de Bothrops alternatus (Viperidae, Crotalinae)
Ano de defesa: | 2005 |
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Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica
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Ciências Biológicas
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Resumo: | Snake venom serine proteinases usually act on the mammal hemostatic system, sometimes resembling the action of trombin, and these enzymes became objects of therapeutical interest against trombosis. In this work we describe the cloning, expression in bacterial system and partial purification of BthaTL, a recombinant serine peptidase with 233 amino acid residues from Bothrops alternatus venom. The cDNA encoding the protein was amplified by Polymerase Chain Reaction coupled with Transcriptase Reverse, reamplified by Polymerase Chain Reaction and cloned in the pGEM-T Easy vector. The cDNA was further subcloned into the pET-28a expression vector, originating pBThaTL plasmid. Transformed with the new plasmid, DH5-α and BL21(DE3) strains were been submitted to expression assays,producing the insoluble recombinant protein as inclusion bodies. Aiming its solubilization, BthaTL was denatured, and refolded in vitro for enzimatic activity recovery. The absence of activity upon fibrinogen and casein showed that the refolding protocol used was ineffective. The primary sequence deduced for the protein evidenced high degree of identity with snake venom thrombin-like serine peptidases, and it was used for the construction of a molecular model based in the three dimensional structure from Trimeresurus stejnejeri venom plasminogen activator (TSV-PA). The substitution of some essential residues in the neighborhoods of the BthaTL catalytic hole in relation to the template indicates that the two proteins do not share the same activity or specificity. Theoretical experiments of phylogenetic reconstruction had corroborated with the taxonomic classification of the snakes species, grouping the non-viperidic and viperinic enzymes in independent branches to those where the crotalinic enzymes had been located. |
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2016-06-22T18:43:20Z2006-03-102016-06-22T18:43:20Z2005-06-03CARDOSO, Ana Flávia Vitorino. Estudos biológicos e estruturais da BthaTL, uma serinopeptidase recombinante da peçonha de Bothrops alternatus (Viperidae, Crotalinae). 2005. 183 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2005.https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/15695Snake venom serine proteinases usually act on the mammal hemostatic system, sometimes resembling the action of trombin, and these enzymes became objects of therapeutical interest against trombosis. In this work we describe the cloning, expression in bacterial system and partial purification of BthaTL, a recombinant serine peptidase with 233 amino acid residues from Bothrops alternatus venom. The cDNA encoding the protein was amplified by Polymerase Chain Reaction coupled with Transcriptase Reverse, reamplified by Polymerase Chain Reaction and cloned in the pGEM-T Easy vector. The cDNA was further subcloned into the pET-28a expression vector, originating pBThaTL plasmid. Transformed with the new plasmid, DH5-α and BL21(DE3) strains were been submitted to expression assays,producing the insoluble recombinant protein as inclusion bodies. Aiming its solubilization, BthaTL was denatured, and refolded in vitro for enzimatic activity recovery. The absence of activity upon fibrinogen and casein showed that the refolding protocol used was ineffective. The primary sequence deduced for the protein evidenced high degree of identity with snake venom thrombin-like serine peptidases, and it was used for the construction of a molecular model based in the three dimensional structure from Trimeresurus stejnejeri venom plasminogen activator (TSV-PA). The substitution of some essential residues in the neighborhoods of the BthaTL catalytic hole in relation to the template indicates that the two proteins do not share the same activity or specificity. Theoretical experiments of phylogenetic reconstruction had corroborated with the taxonomic classification of the snakes species, grouping the non-viperidic and viperinic enzymes in independent branches to those where the crotalinic enzymes had been located.Serinopeptidases de peçonhas ofídicas usualmente atuam sobre o sistema hemostático de mamíferos, algumas vezes mimetizando a ação da trombina, o que as torna objetos de interesse terapêutico contra a trombose. Neste trabalho descrevemos a clonagem, expressão em sistema bacteriano e purificação parcial da BthaTL, uma serinopeptidase recombinante com 233 resíduos de aminoácidos da peçonha de Bothrops alternatus. O cDNA codificante da proteína foi amplificado por uma Reação em Cadeia da Polimerase associada à ação da enzima Transcriptase Reversa, reamplificado por uma Reação em Cadeia da Polimerase e clonado no vetor pGEM-T Easy. Posteriormente, o cDNA foi subclonado no vetor de expressão pET-28a, originando o plasmídeo pBthaTL. Transformadas com o novo plasmídeo, as linhagens DH5-α e BL21(DE3) foram submetidas a ensaios de expressão, produzindo a proteína recombinante insolúvel na forma de corpos de inclusão. Visando sua solubilização, a BthaTL foi desnaturada, e re-enovelada in vitro para a recuperação da atividade enzimática. A ausência de atividade sobre o fibrinogênio e a caseína mostrou que o protocolo de re-enovelamento utilizado não foi efetivo. A seqüência primária deduzida para a proteína evidenciou alto grau de identidade com serinopeptidases trombina-símile de peçonhas ofídicas, sendo aplicada na construção de um modelo molecular baseado na estrutura tridimensional da enzima ativadora de plasminogênio da peçonha de Trimeresurus stejnejeri (TSV-PA). A substituição de alguns resíduos essenciais nas proximidades da fenda catalítica da BthaTL em relação ao molde indica que as duas proteínas não compartilham a mesma atividade ou especificidade. Experimentos teóricos de reconstrução filogenética corroboraram com a classificação das espécies de serpentes, agrupando as enzimas não viperídicas e as viperínicas em ramos independentes àqueles onde foram posicionadas as enzimas crotalínicas.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São PauloDoutor em Genética e Bioquímicaapplication/pdfporUniversidade Federal de UberlândiaPrograma de Pós-graduação em Genética e BioquímicaUFUBRCiências BiológicasSerinopeptidaseBothrops alternatusProteína recombinanteCobra venenosa- VenenoProteinaseSerina proteinasesProteínasCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICAEstudos biológicos e estruturais da BthaTL, uma serinopeptidase recombinante da peçonha de Bothrops alternatus (Viperidae, Crotalinae)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisAraujo, Heloisa Sobreiro Selistre dehttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787059Y2Brandeburgo, Maria Inês Homsihttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790922T9Paula, Cecilia Lomônaco dehttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783667D4Ward, Richard Johnhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4795418H8Espindola, Foued Salmenhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727087Y6http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4701853Z1Cardoso, Ana Flávia Vitorinoinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UFUinstname:Universidade Federal de Uberlândia (UFU)instacron:UFUTHUMBNAILAFVCardoso1TESPRT.pdf.jpgAFVCardoso1TESPRT.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1364https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15695/5/AFVCardoso1TESPRT.pdf.jpg9b18ed33fe7cf4a70d8e6b0cf15f6414MD55AFVCardoso2TESPRT.pdf.jpgAFVCardoso2TESPRT.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1007https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15695/6/AFVCardoso2TESPRT.pdf.jpgbbea2960d2ebbbbaa0da0823164c8550MD56ORIGINALAFVCardoso1TESPRT.pdfapplication/pdf1589951https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15695/1/AFVCardoso1TESPRT.pdf334073d671ae09c77d946cc229d2870dMD51AFVCardoso2TESPRT.pdfapplication/pdf1151865https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15695/2/AFVCardoso2TESPRT.pdf7a274d8e8e6ef4c043c1006823c97b95MD52TEXTAFVCardoso1TESPRT.pdf.txtAFVCardoso1TESPRT.pdf.txtExtracted texttext/plain174828https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15695/3/AFVCardoso1TESPRT.pdf.txte21543dd766cc9f16c6256472870961fMD53AFVCardoso2TESPRT.pdf.txtAFVCardoso2TESPRT.pdf.txtExtracted texttext/plain111855https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15695/4/AFVCardoso2TESPRT.pdf.txtd3cb50160d1794b469eaef4ab0a2f01cMD54123456789/156952016-06-23 04:13:50.252oai:repositorio.ufu.br:123456789/15695Repositório InstitucionalONGhttp://repositorio.ufu.br/oai/requestdiinf@dirbi.ufu.bropendoar:2016-06-23T07:13:50Repositório Institucional da UFU - Universidade Federal de Uberlândia (UFU)false |
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