Melhoramento da tolerância de plantas a estresses biótico e abiótico : uso de regulação transcricional por CRISPR/ dCas9 e algodão transgênico

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2018
Autor(a) principal: Paixão, Joaquin Felipe Roca
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: spa
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Estresse hídrico
Algodão - doenças e pragas
Algodão
Plantas transgênicas
Link de acesso: https://repositorio.unb.br/handle/10482/35826
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2018.
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spelling Melhoramento da tolerância de plantas a estresses biótico e abiótico : uso de regulação transcricional por CRISPR/ dCas9 e algodão transgênicoBiotechnological improvement of plants against Biotic and Abiotic stresses : use of CRISPR/ dCas9 transcriptional regulation and transgenic cottonEstresse hídricoAlgodão - doenças e pragasAlgodãoPlantas transgênicasTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2018.Como organismos sésseis, as plantas evoluem em direção a uma flexibilidade no desenvolvimento fisiológico para se adaptarem a estresses bióticos e abióticos e que freqüentemente ocorrem simultaneamente. O estresse hídrico afeta diferentes aspectos da fisiologia das plantas e pode diminuir seu crescimento e produtividade. Meloidogyne incognita é um nematoide de galhas que infecta e modifica a estrutura das raízes das plantas. Em um aspecto agronômico, ambos estresses representam um custo econômico elevado. A manipulação genética de genomas de plantas pode superar alguns destes obstáculos. Inicialmente, implementamos uma estratégia CRISPR / dCas9 em Arabidopsis para melhorar a tolerância à seca. Em seguida, introduzimos um cassete em plantas de algodão para induzir a tolerância ao estresse hídrico e a resistência ao M. incognita ao mesmo tempo. O sistema CRISPR/Cas tipo II foi adaptado em plantas para controlar a modificação genética em um procedimento mais direcionado e preciso. Com o intuito de controlar a tolerância ao estresse hídrico, utilizamos os mecanismos CRISPRi/CRISPRa, que empregam a «dead Cas9» fusionada à moduladores transcricionais. Avaliou-se o uso da dCas9 fusionada com ativador VPR e com dois domínios de modificação epigenética de Arabidopsis: O domínio Acetiltransferase de AtHAC1 (domínio HAT) e o domínio metiltransferase do gene CURLY LEAF (CLF) (domínio SET). Nossos resultados mostraram que as dCas9 fusionadas a VPR e HAT aumentaram a atividade de promotores controlando um gene repórter. A estratégia também foi testada para controlar o promotor endógeno do fator de transcrição AtAREB1. A expressão de AREB1 foi aumentada em plantas portadoras das fusões dCas9HAT, plantas que apresentaram melhor tolerância ao estresse hídrico. Os dados indicam que modificações epigenéticas específicas de histonas podem ser usadas para modificar a atividade do promotor em plantas. Neste estudo melhoramos a resposta das plantas ao estresse hídrico, mas a abordagem pode ser projetada para controlar qualquer promotor e incluir respostas a outros estresses. Em uma abordagem mais clássica, nós projetamos plantas geneticamente modificadas (GM) de algodão, impulsionando a expressão de AREB1ΔQT. Dentro da mesma construção foram desenhados a expressão do gene AREB1ΔQT e o dsRNA para um gene essencial em M. incognita, que codifica para um fator de splicing. Foram obtidas linhagens de algodão GM que demonstraram melhor resposta ao estresse hídrico e à infecção por nematoides, na geração T1. A termo, ambas as estratégias representam novas oportunidades atraentes na biotecnologia vegetal.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).adaptation mechanisms against different abiotic and biotic stresses that often occur simultaneously. Water stress impacts different aspects of plant physiology, and can decrease their growth and productivity. Meloidogyne incognita is a root-knot nematode that infects and modifies the structure of plant roots. In an agronomical aspect, both stress episodes represent an elevated economic cost. Genetic manipulation of plant genomes can overcome some of these obstacles. We first implemented a CRISPR/dCas9 strategy in Arabidopsis to improve drought stress tolerance. Then, we introduced a cassette in cotton plants to induce drought stress tolerance and M. incognita resistance at the same time. The type II CRISPR/Cas system has been adapted in plants to control the genetic modification in a more targeted and precise procedure. In the light of controlling drought stress tolerance, we used the CRISPRi/CRISPRa mechanisms which make use of an engineered dead Cas9 fused to transcriptional modulators to regulate transcription. We evaluated the use the dCas9 fused to the tripartite activator VPR and two Arabidopsis epigenetic modification domains: The Acetyltransferase domain from AtHAC1 (HAT domain), and the methyltransferase domain from CURLY LEAF (CLF) gene (SET domain). During a transient assay, our results showed that the dCas9 fused to VPR and HAT increased the activity of promoters controlling a reporter gene, whereas the SET domain showed contrasted results. The strategy was also tested to control the endogene promoter of the transcription factor AtAREB1, known to control key genes in the response to drought stress. The AREB1 expression was increased in plants carrying the dCas9HAT fusions, plants that showed a better tolerance to drought stress. Our data indicates that targeted epigenetic histone modifications can be used to modify promoter activity in plants. Here, we improved plant’s response to drought stress, but the approach can be designed to control any promoter and include responses to other stresses. In a more classical approach, we engineered cotton genetically modified plants driving expression of AREB1ΔQT, a constitutive form of AREB1 transcription factor. We expressed within the same construct an RNAi targeting an essential gene in M. incognita that encodes for a splicing factor. We obtained three lines of GM cotton that had a better response to water withdrawal and nematode infection in the T1 generation. At term, both strategies represent new attractive opportunities in plant biotechnology.Sá, Maria Fátima Grossi dePaixão, Joaquin Felipe Roca2019-11-13T20:36:27Z2019-11-13T20:36:27Z2019-11-132018-06-08info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfPAIXÃO, Joaquin Felipe Roca. Melhoramento da tolerância de plantas a estresses biótico e abiótico: uso de regulação transcricional por CRISPR/dCas9 e algodão transgênico. 2018. 119 f., il. Tese (Doutorado em Biotecnologia e Biodiversidade)—Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2018.https://repositorio.unb.br/handle/10482/35826Inglêsspainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-25T02:25:49Zoai:repositorio.unb.br:10482/35826Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-25T02:25:49Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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