Expressão heteróloga e deleção da otubaína de Trypanosoma cruzi (otutc) por intermédio do sistema CRISPR/ Cas9

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2019
Autor(a) principal: Barroso, Allan Mascarenhas Amaral
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Não Informado pela instituição
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Doença de Chagas
Proteases
Otubaína
Chagas, Doença de - tratamento
Link de acesso: https://repositorio.unb.br/handle/10482/37379
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
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spelling Expressão heteróloga e deleção da otubaína de Trypanosoma cruzi (otutc) por intermédio do sistema CRISPR/ Cas9Doença de ChagasProteasesOtubaínaChagas, Doença de - tratamentoDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi e transmitida por invertebrados pertencentes à subfamília Triatominae. Endêmica da América Latina, trata-se de uma doença tropical negligenciada para a qual os tratamentos disponíveis são ineficazes, exigindo, assim, novas alternativas terapêuticas. As proteases, enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas, estão envolvidas na regulação de diversos processos fisiológicos e, por conseguinte, têm sido objetos de estudos como potenciais alvos farmacêuticos em diversas doenças. A aplicação de CRISPR/Cas9, ferramenta biotecnológica de edição gênica, tem corroborado na elucidação do papel biológico de sequências gênicas diversas, podendo, também, ser aplicada para o entendimento do papel das sequências codificadoras para proteases. Neste contexto, este trabalho visou estudar o papel de uma cisteíno-protease do tipo otubaína mediante sua expressão heteróloga e deleção de ao menos um de seus alelos na cepa CL Brener de T. cruzi, de modo a estabelecer uma linhagem deletéria para o gene. Assim, o gene otutc foi clonado no vetor de expressão pET19b e expresso em Escherichia coli. Obteve-se, então, a otubaína recombinante (rOtuTc) purificada a partir da fração solúvel. A rOtuTc foi capaz de hidrolisar o substrato tetra-ubiquitina de origem humana (K48), sugerindo apresentar um papel de desubiquitinase. A linhagem ... de T. cruzi foi transfectada com RNA guia específico para otutc ou com cassetes indutores de recombinação homóloga no locus de interesse. Obteve-se cinco clones carreando o gene bsd, o qual confere resistêcia à marca de seleção blasticidina e que compõe um dos cassetes construídos e transfectados, sugerindo uma possível deleção de ao menos um dos alelos de otutc. Em conjunto, a obtenção tanto da proteína recombinante quanto de linhagens deletérias para otutc podem ajudar na elucidação do papel desse gene na biologia de T. cruzi, podendo despontar como um possível alvo farmacêutico para a doença de Chagas.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Empreendimentos Científicos e Tecnológicos (FINATEC).Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi and is transmitted by invertebrates belonging to the subfamily Triatominae. Endemic in Latin America, it is a neglected tropical disease for which available treatments are ineffective, thus requiring new therapeutic alternatives. Proteases, enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds, are involved in the regulation of various physiological processes and, therefore, have been studied as potential pharmaceutical targets in various diseases. The application of CRISPR / Cas9, a genetic editing biotechnological tool, has corroborated to the elucidation of the biological role of diverses gene sequences and can also be applied to understand the role of protease coding sequences. In this context, this work aimed to study the role of an otubain-like cysteine protease by its heterologous expression and deletion of, at least, one of its alleles in the T. cruzi CL Brener strain, in order to establish a deleterious lineage for the gene. Thus, the otutc gene was cloned into the pET19b expression vector and expressed in Escherichia coli. Purified recombinant otubain (rOtuTc) was then obtained from the soluble fraction. rOtuTc was able to hydrolyze the tetra-ubiquitin substrate of human origin (K48), suggesting to play a role of a deubiquitinase. The T. cruzi strain was transfected with target-specific RNA or homologous recombinant inducing cassettes at the locus of interest. Five clones bearing the bsd gene were obtained, which confers resistance to the blasticidine selection marker and which makes up one of the constructed and transfected cassettes, suggesting a possible deletion of, at least, one of the other alleles. Together, obtaining both recombinant protein and deleterious strains for otutc may help to elucidate the role of this gene in T. cruzi biology and may emerge as a possible pharmaceutical target for Chagas disease.Bastos, Izabela Marques DouradoBarroso, Allan Mascarenhas Amaral2020-04-07T13:30:10Z2020-04-07T13:30:10Z2020-04-072019-07-31info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfBARROSO, Allan Mascarenhas Amaral. Expressão heteróloga e deleção da otubaína de Trypanosoma cruzi (otutc) por intermédio do sistema CRISPR/ Cas9. 2019. 132 f. il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.https://repositorio.unb.br/handle/10482/37379A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T20:52:04Zoai:repositorio.unb.br:10482/37379Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T20:52:04Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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