Adição de ácido linolênico e L-carnitina na maturação oocitária: efeitos sobre o metabolismo celular, potencial de desenvolvimento e criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Leão, Beatriz Caetano da Silva [UNESP]
• Orientador(a): Mingoti, Gisele Zoccal [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Ácido linolênico; L-carnitina; Maturação in vitro; Acúmulo lipídico; Criotolerância embrionária
• Palavras-chave em Inglês: Linolenic acid; L-carnitine; In vitro maturation; Lipid content; Embryo cryotolerance
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/135857

Com o intuito de aperfeiçoar os resultados da criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV), este estudo foi conduzido com o objetivo principal de avaliar o impacto da suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com ácido linolênico (ALA), associado ou não à L-carnitina (L-car), sobre a maturação e qualidade do oócito, especialmente no que se refere ao metabolismo lipídico, e sobre o desenvolvimento e resistência à criopreservação dos embriões produzidos. Para tanto, em uma primeira etapa (Experimentos I e II) foram realizados experimentos de dose-resposta para determinar as concentrações ideais de ALA (0, 10, 50 ou 100 µM) e L-car (0, 1, 5 ou 10 mM) a serem adicionadas ao meio de MIV, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) ou 0,6% de albumina sérica bovina (BSA). Foram avaliados os efeitos do ALA e L-car sobre a maturação nuclear e citoplasmática (avaliação mitocondrial, acúmulo lipídico intracelular e produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) em oócitos bovinos) e o subsequente desenvolvimento embrionário. No Experimento I, a adição de 100 µM de ALA em meio de MIV suplementado com SFB resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático e do acúmulo intracelular de ROS, assim como aumento (P<0,05) do potencial de membrana mitocondrial (PMM), em relação às demais concentrações de ALA. No entanto, nenhum desses efeitos prejudicou (P>0,05) a maturação oocitária e o subsequente potencial de desenvolvimento embrionário. No Experimento II, a suplementação do meio de MIV com L-car resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático, na presença de SFB. Somados os efeitos da concentração de 10 mM de L-car na presença de SFB sobre a redução (P<0,05) do PMM e elevação (P<0,05) do conteúdo de ROS e, do efeito negativo (P<0,05) da suplementação do meio de MIV com BSA sobre o desenvolvimento embrionário, conclui-se que a suplementação com 5 mM de L-car na presença de SFB superou os resultados dos demais grupos. Em uma segunda etapa (Experimento III), baseado nos resultados dos experimentos anteriores foi avaliado o efeito da suplementação com ALA (100 µM), L-car (5mM) ou a associação de ambos os tratamentos (ALA + L-car), durante o cultivo de MIV com 10% de SFB, sobre o subsequente desenvolvimento in vitro, qualidade embrionária (avaliada pela contagem do número total de células e taxa de apoptose), conteúdo intracelular de ROS e acúmulo lipídico intracitoplasmático, além da criotolerância embrionária. Para tanto, oócitos foram fecundados durante 24 horas e os prováveis zigotos cultivados in vitro (CIV). Foram avaliadas a taxa de clivagem (48 hpi) e o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (D7 do CIV). Estes foram vitrificados e posteriormente reaquecidos para avaliação da sobrevivência embrionária pós-criopreservação, após 24 h e, taxa de eclosão após 48 h de re-cultivo in vitro. Também nesta etapa, foi avaliada a regulação da expressão de genes envolvidos com o metabolismo lipídico (regulação da lipogênese: SCD1, FASN e SREBP1; regulação da via metabólica de β-oxidação: CPT1B e CPT2), em oócitos suplementados com ALA e/ou L-carnitina durante o cultivo de MIV, e nos embriões produzidos. Os tratamentos com ALA e L-car realizados na etapa de MIV não suportaram os efeitos positivos observados nos estudos anteriores sobre a redução do acúmulo lipídico e melhora do potencial de desenvolvimento oocitário. Os tratamentos não alteraram o conteúdo lipídico e consequentemente a criotolerância dos embriões resultantes. Apesar disso, houve melhora da qualidade embrionária pela redução do índice apoptótico e acúmulo de ROS. A expressão dos genes relacionados à lipogênese sofreram influência do tratamento com os suplementos realizado na MIV. Porém, para os genes relacionados à lipólise, um possível efeito positivo foi perdido e, talvez seja necessário o tratamento na etapa de CIV. Portanto, mais estudos são necessários para avaliar a etapa mais adequada da PIV para se realizar a suplementação com ALA, L-car e a associação de ambos os tratamentos, objetivando alterar o conteúdo lipídico e consequentemente a criotolerância embrionária.