Análise DNA dupla-fita por eletroforese capilar acoplado a um detector com arranjo de diodos

• Ano de defesa: 2001
• Autor(a) principal: Caruso, Celia Sulzbacher
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: análise de ácidos nucleicos; capillary electrophoresis; caracterização molecular; detector de arranjo de diodos; diode array detector; DNA dupla-fita; double-stranded DNA; eletroforese capilar; molecular characterization; nucleic acid analysis
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75132/tde-02102025-093116/

Por diversas décadas, a eletroforese em gel tem sido uma das ferramentas mais importantes em laboratórios de biologia molecular para a análise de macromoléculas. Nos últimos 15 anos, a eletroforese capilar (CE) tem demonstrado vantagens em relação à eletroforese em gel, embora apresente limitações quanto à análise simultânea de amostras. Para superar essa dificuldade, instrumentos de eletroforese capilar com arranjo de capilares (CAE) têm sido avaliados, e alguns já estão disponíveis comercialmente. Neste trabalho, utilizou-se um equipamento comercial de CE, dotado de um único capilar acoplado a um detector com arranjo linear de fotodiodos (DAD), aplicado à detecção multiplexada de amostras de DNA mediante a adição de moléculas fluorescentes denominadas intercaladores. Diferentes padrões de DNA foram submetidos à separação eletroforética de fragmentos de DNA fita dupla (dsDNA), com tamanhos variando de 36 a 2645 pares de bases (bp). O tampão de separação consistiu em 100 mM de Tris-TAPS-EDTA (100 mM de Tris-TAPS e 2 mM de EDTA), e diferentes soluções poliméricas substituíveis foram empregadas como meio de separação. As amostras de DNA foram injetadas no capilar variando-se o tempo de injeção, o campo elétrico aplicado e a temperatura de separação. A qualidade da separação dos complexos DNA-corante foi aprimorada com o uso de tampões contendo íons tetrapentilamônio como único cátion. Os resultados sugerem que separações eletroforéticas simultâneas de diferentes padrões de DNA, multiplexados com distintos intercaladores, podem ser realizadas em um mesmo capilar, possibilitando uma ampla faixa de separação por tamanho. Observou-se que a presença de intercaladores reduz a eficiência da separação quando comparada à análise de DNA não intercalado. Por outro lado, a adição de corantes aumenta a seletividade da separação e, consequentemente, a exatidão na determinação do tamanho dos fragmentos. Dessa forma, análises por CE - frequentemente substituídas pela eletroforese em gel no processamento simultâneo de amostras - podem agora superar essa desvantagem, permitindo análises multiplexadas em tempos competitivos em relação às análises em gel. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um método robusto para a análise multiplexada de amostras de dsDNA, complexadas com diferentes tipos de intercaladores, empregando soluções poliméricas diluídas. O estudo estabelece condições para a aplicação de um método validado e caracterizado na análise de produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR) e em testes de paternidade. Foram avaliados parâmetros como a exatidão de determinação do tamanho, a variação linear e o tempo de análise, com e sem a adição de corantes à solução polimérica.