Estrutura cristalográfica da enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de T.cruzi:implicações no mecanismo catalítico e potenciais sitios específicos de inibição

• Ano de defesa: 1996
• Autor(a) principal: Souza, Dulce Helena Ferreira de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: T.cruzi; cristalografia; crystallography; GAPDH; proteínas; proteins
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75131/tde-28072025-100141/

A enzima glicolítica Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase (GAPDH) de T.cruzi foi expressa em bactéria E.coli e purificada, de acordo com Hannaert e colaboradores, com algumas modificações que permitiram maiores rendimento e pureza da enzima. Os testes de cristalização da enzima foram feitos com 50 soluções constituídas por diversos tampões, sais e agentes precipitantes. Cristais de GAPDH de T.cruzi, medindo aproximadamente 0.1x0.2x0.2 mm3 foram obtidos a 4ºC pelo método de difusão de vapor com gotas \"penduradas \". A enzima cristaliza-se no sistema cristalino triclinico, grupo espacial Pl, com oito monômeros na unidade assimétrica. A coleta dos dados de difração foi feita em um difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Corporation. A estrutura tridimensional da GAPDH de T.cruzi foi determinada pelo método de Substituição Molecular utilizando o pacote de programas AMoRe. O refinamento do modelo por \"simulated annealing\" foi feito com o programa X-PLOR. Simetria não cristalográfica foi imposta durante o refinamento, implicando que somente um dos oito monômeros foi considerado independente na cela unitária. Os fatores de discordância Rfactor e Rfree para o modelo final contendo 359 resíduos, 1 molécula de NAD+ e 90 moléculas de água, foi de 20.1% e 22.3% respectivamente . Através da análise da estrutura foi possível propor que o sítio de ligação do NAD+ é um alvo potencial para o desenho de drogas, similarmente ao observado para T.brucei e L.mexicana. Diferentemente de todas as outras estruturas de GAPDH conhecidas, a enzima de T.cruzi não apresenta íons sulfato ou fosfato no sítio ativo. Este comportamento resultou no rearranjo conformacional de um resíduo Arginina (Arg249) que é então proposto ser fundamental no mecanismo que regula a entrada e saída do substrato/produto da reação. A comparação com a GAPDH humana indica que este sítio poderia ser também um bom alvo para desenho de inibidores específicos.