Produção de 1,3-propanodiol por Clostridium beijerinckii Br21 a partir de glicerol: expressão gênica das principais enzimas envolvidas e manipulação genética por transformação

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Bortolucci, Jonatã
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: 1,3-propanediol dehydrogenase; 1,3-propanodiol desidrogenase; Electroporation; Eletroporação; Glicerol quinase; Glicerol-3-fosfato desidrogenase; Glycerol kinase; Glycerol-3-phosphate dehydrogenase; Overexpression; pMTL83251; RT-qPCR; Superexpressão
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-22032023-101621/

A bioeconomia como substituição ao modelo econômico atual é a alternativa mais discutida nas últimas décadas, como forma de diminuição da dependência de recursos fósseis, caracterizados como poluentes e não-renováveis. Os processos biotecnológicos desenvolvidos em biorrefinarias são considerados como uma das alternativas mais atraentes na valorização de biomassas, convertendo-as em bioprodutos, biocombustíveis e bioenergia. Por exemplo, o biodiesel pode ser obtido a partir de óleos e gorduras, porém gera glicerol como subproduto. A utilização do glicerol como fonte de carbono tem sido estudada em vários bioprocessos, dentre os quais destaca-se a sua conversão a 1,3-propanodiol (1,3-PDO) por bactérias do gênero Clostridium. A metabolização do glicerol ocorre por duas vias, uma oxidativa, pelas enzimas glicerol desidrogenase (GDH) e di-hidroxiacetona quinase (DHAK), ou glicerol quinase (GK) e glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPDH); e outra redutiva, pelas enzimas glicerol desidratase (GDHt) e 1,3-propanodiol desidrogenase (PDODH), sendo que a produtividade final de 1,3-PDO é dependente da expressão gênica destas enzimas. Neste trabalho, estudou-se o isolado Clostridium beijerinckii Br21, para o qual foram investigadas as condições nutricionais de fermentação e a expressão de enzimas envolvidas no processo de oxidação/redução de glicerol. Tais investigações também foram efetuadas e comparadas a uma cepa referência, Clostridium pasteurianum DSM 525. Finalmente, estudou-se a manipulação genética de C. beijerinckii Br21, para aprimorar a obtenção de 1,3-PDO. Comparando a fermentação da cepa Br21 em meio bastante nutritivo (RCM) e pouco nutritivo (WIS, descrito por (WISCHRAL et al., 2015)), verifica-se a obtenção de 1,3-PDO somente em condições de menor disponibilidade nutricional. A concentração final de 1,3-PDO obtida em meio WIS é similar à obtida por C. pasteurianum DSM 525. Além disso, a expressão de GPDH na cepa Br21 em meio WIS é baixa, possivelmente indicando limitação da velocidade de oxidação do glicerol via GK. Dessa forma, esta oxidação provavelmente ocorre via GDH/DHAK. Quanto à redução do glicerol, a expressão gênica de PDODH foi similar para as cepas Br21 e DSM 525. Com o intuito de aumentar a expressão gênica de redução do glicerol, realizou-se a transformação de C. beijerinckii Br21, utilizando o plasmídeo pMTL83251 contendo os genes codificantes das enzimas GDHt, cobalamina adenosiltransferase e PDODH, sob controle do promotor codificante das enzimas fosfotransacetilase/acetato quinase. Após a seleção e aperfeiçoamento de um método descrito na literatura, a transformação por eletroporação para promover a superexpressão gênica de GDHt, cobalamina adenosiltransferase e PDODH foi bem-sucedida. A superexpressão desses genes promoveu o aumento da produtividade de 1,3-PDO, porém não houve aumento da concentração final deste composto. Este estudo contribuiu para o melhor entendimento das vias de transformação de glicerol a 1,3-PDO por um isolado de C. beijerinckii, além de possibilitar a adaptação de um método de transformação para o mesmo.