Emprego da reação em cadeia pela polimerase em tempo real para o controle de eficiência de bacterinas anti-leptospirose

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Dib, Cristina Corsi
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Bacterinas; Bacterins; ELISA; Hamsters; Leptospirose; Leptospirosis; Real Time PCR
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-27092012-164459/

A estirpe Fromm de Leptospira interrogans sorovar Kennewicki foi utilizada para produção de uma bacterina experimental anti-leptospirose. A extração do RNA total utilizado para transcrição reversa e quantificação dos antígenos LigA e LipL32 por PCR em Tempo Real, foi efetuada a partir de alíquotas colhidas das diluições da bacterina antes da sua inativação, as quais foram armazenadas à temperatura de -80ºC. O volume restante da bacterina foi inativado em banho-maria à 56ºC e mantido à temperatura de -20ºC para avaliação da sua potência em hamsters bem como da detecção e quantificação dos antígenos LigA e LipL32 em ensaios de ELISA Indireto e ELISA Sanduíche Indireto. Os resultados do ensaio de potência em hamsters demonstraram que a bacterina foi aprovada de acordo com as exigências dos padrões internacionais de qualidade até a diluição 1/6400, protegendo os hamters contra a infecção letal frente ao desafio com a diluição 10-6 (100 doses infectantes 50%/ 0,2mL). Os resultados das reações de Real Time PCR detectaram 3,2 x 103 e 2,3 x 101 cópias do mRNA que codifica a proteína LigA, na bacterina pura e diluída a 1:200, respectivamente. Apenas oito cópias do mRNA que codifica a proteína LipL32 foram detectadas na amostra de bacterina pura. Os ensaios com ELISA Indireto não detectaram a proteína LigA na amostra de bacterina inativada, mas demonstraram a detecção da proteína LipL32 até a diluição 1/1600 da bacterina. Os ensaios de ELISA Sanduíche Indireto apresentaram reações cruzadas nas placas controle, e, portanto seus resultados não puderam ser considerados nas análises. Os resultados da real time PCR não puderam ser correlacionados com o teste de potência em hamsters, mas os ensaios de ELISA Indireto para a proteína LipL32 demonstraram resultados condizentes com os apresentados pelo teste de potência em hamsters oferecendo uma possível alternativa in vitro para avaliação de potência de bacterinas anti-leptospirose.