Desenvolvimento de um método de qPCR para quantificação e diferenciação de cepas de patógenos intracelulares

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Ishimoto, Adriene Yumi
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Carga parasitária; Diagnóstico molecular; Genotipagem; Genotyping; Leishmaniasis; Leishmaniose; Molecular diagnosis; Parasite burden; SARS-CoV-2
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-04042025-095442/

Desenvolvimento de um Método de qPCR para Quantificação e Diferenciação de Cepas de Patógenos Intracelulares A Leishmaniose é uma doença negligenciada causada parasitos intracelulares obrigatórios do gênero Leishmania. A doença apresenta diferentes manifestações clínicas, como Leishmaniose Cutânea (LC), Mucocutânea (ML) e Visceral (VL) que dependem da espécie de Leishmania infectante, bem como o fator genético do hospedeiro e da resposta imunológica. De acordo com a OMS e o CDC, a detecção do DNA do parasito por qPCR melhora a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico, e também permite a quantificação do parasito nas amostras. Contudo, o diagnóstico de Leishmaniose atualmente utilizado apresenta várias limitações e desvantagens. Assim, um método eficiente capaz de detectar e monitorar a carga parasitária é crucial para o controle da doença. Neste estudo, desenvolvemos um método baseado em qPCR para a detecção e quantificação de diferentes espécies de Leishmania em tecidos ou em células hospedeiras de mamíferos infectadas. O método permitiu diferenciar especificamente as espécies L. braziliensis e L. amazonensis utilizando reagentes TaqMan, enquanto o reagente SYBR Green foi capaz de classificar as espécies em três grupos: L. braziliensis e L. guyanensis; L. amazonensis, L. donovani e L. infantum; L. major e L. mexicana. A metodologia também permitiu a quantificação de até um único parasita em amostras de diferentes tecidos infectados, demonstrando uma alta sensibilidade. Utilizando o método desenvolvido, foi possível observar a disseminação de L. braziliensis em camundongos Nos2-/- pela detecção dos parasitos em leucócitos no período inicial da infecção, e no fígado e baço em períodos mais tardios. Ademais, o método permitiu rastrear sítios de persistência da infecção por L. braziliensis em camundongos C57BL/6 infectados por até 40 semanas. Esta mesma estratégia foi aplicada para diferenciar as variantes de SARS-CoV-2 por RT-PCR. O método foi capaz de identificar a cepa Parental e a variante Gama utilizando a tecnologia SYBR Green, e esse ensaio foi usado para classificar os pacientes de COVID-19 de acordo com a variante infectante. O desenvolvimento de um método específico e sensível baseado em PCR para diferenciação de cepas de patógenos intracelulares pode contribuir para o diagnóstico, tratamento e controle das doenças causadas por estes patógenos.