Estrutura cristalográfica da proteína Thi1 de Arabidopsis thaliana

• Ano de defesa: 2002
• Autor(a) principal: Godoi, Paulo Henrique Conaggin
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Arabidopsis thaliana; Arabidosis thaliana; crystallography; estrutura cristalográfica; protein structure; THI1
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75131/tde-20082025-171941/

Com o objetivo de investigar a função biológica do gene thil de Arabidopsis thaliana, a estrutura tridimensional da proteína Thil-P foi determinada até 1,6 Å de resolução. Descreve-se aqui todo o procedimento experimental realizado, compreendendo as etapas de subclonagem do gene em diversas construções, a expressão heteróloga em Escherichia coli, purificação das proteínas produzidas e de amostras modificadas por digestão enzimática, cristalização, coleta de dados e processamento, cálculo das fases, interpretação dos mapas de densidade eletrônica e refinamento parcial de um modelo molecular. O gene thil foi subclonado e expresso em E. coli utilizando diferentes vetores de expressão e modificações da sequência gênica com o propósito de produzir amostras adequadas à cristalização. Cristais de Thil-P foram obtidos por difusão de vapor em gota depositada contra uma solução de MES 100 mM, pH 6,0, MPD 40% e 1,2,3-heptanotriol 1,5% (w/v). A coleta de dados de cristais de Thil-P em condições criogênicas foi realizada na linha ID29 do European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), buscando otimizar o sinal de dispersão anômala em múltiplos comprimentos de onda (MAD) nas bordas de Zn e Pt. A determinação das fases iniciais, por sua vez, somente foi possível pela combinação dos métodos de dispersão anômala em um comprimento de onda (SAD) e modificação da densidade eletrônica no espaço recíproco, utilizando os programas SOLVE e RESOLVE e o conjunto de dados medido no máximo de emissão de fluorescência de Zn (λ 1,28269 Å). O modelo molecular que descreve a estrutura tridimensional de Thil-P foi construído utilizando-se o programa ARP/wARP e, por intervenção manual, utilizando o programa O. Apesar do refinamento ainda não estar concluído, a estrutura de Thil-P pode ser descrita na classe α/β, arquitetura do tipo 3-layer (ββα) sandwich, com uma topologia semelhante aos domínios de ligação de FAD/NAD(P), contendo um ligante identificado como uma adição de ADP a 4-metil-5-β-hidroxietil tiazol, com um radical ligado na posição C2 do anel de tiazol (ATZ).