Expressão, purificação e cristalização de Thi1, proteína envolvida na biossíntese de tiamina e no reparo de lesões de DNA

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 1998
Autor(a) principal: Godoi, Paulo Henrique Conaggin
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Dissertação
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
biossíntese
biosynthesis
cristalização
crystallization
expressão
expression
protein
proteína
purificação
purification
THI1
thiamine
tiamina
vitamin B1
vitamina B1
Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75131/tde-03072025-114818/
Resumo: Esta dissertação é parte de um projeto de pesquisa no qual pretende-se determinar a estrutura tridimensional da proteína Thi 1, recentemente identificada, e possivelmente relàcionada ao reparo de DNA em Arabidopsis thaliana assim como na biossíntese do anel de tiazol de tiamina (vitamina B1). O mecanismo catalítico desempenhado por essa proteína também deverá ser proposto se possível. O gene thil e sua forma deletada ΔN2, sem as bases que codificam para os primeiros 55 aminoácidos, previamente identificados como um peptídeo de translocação para o cloroplasto, foram subclonados em um plasmídeo pET-28 e inseridos imediatamente após uma sequência de 6 histidinas consecutivas. Este procedimento permitiu a expressão em larga escala de ambas as proteínas, entretanto, apenas a proteína deletada pode ser purificada em uma coluna de afinidade contendo íons de níquel imobilizados. A proteína recombinante foi cristalizada a 4ºC, inicialmente em duas condições diferentes, sendo a mais fovorável em tampão Bicina 100mM pH8,8 contendo (NH4)2SO4 800mM, apresentando um hábito de placas finas. Apesar disso, novos experimentos objetivando a melhora do hábito cristalino forneceram resultados favoráveis até o momento e continuam sendo desenvolvidas. A coleta de dados deverá ser feita no próprio laboratório e em fonte de luz síncrotron. Devido a falta de homologia com qualquer outra proteína com estrutura tridimensional conhecida, a estratégia a ser adotada para a resolução da estrutura será a de substituição isomorfa múltipla, requerendo ao menos dois derivados de átomos pesados da proteína.
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