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Sequenciamento de RNA de células únicas (scRNA-seq) revela os efeitos da mutação no exon 6 do gene regulador autoimune (Aire) induzidas por CRISPR-Cas9 sobre a expressão de mRNAs e lncRNAs em células mTEC

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2024
Autor(a) principal: Duarte, Max Jordan de Souza
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Autoimmune regulator gene (Aire)
CRISPR-Cas9
CRISPR/Cas9
Gene regulador autoimune (Aire)
LncRNAs
Sequenciamento de RNA de células únicas (scRNA-seq)
Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)
Thymus
Timo
Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-04042025-170715/
Resumo: O gene regulador autoimune (Aire), um fator de transcrição não clássico em células epiteliais medulares tímicas (mTECs), desempenha um papel na regulação da expressão de genes de autoantígenos de tecidos periféricos (PTAs) essenciais para a tolerância imunológica central. Mais de 100 mutações de Aire já foram descritas incluindo mutações pontuais até grandes deleções na sequência codificadora. Mutações de Aire estão associadas ao aparecimento de doenças autoimunes sendo a síndrome poliendocrinopatia autoimune do tipo 1 (APS-1) a mais frequente. A sequência nucleotídica de Aire é altamente conservada entre humanos e camundongos. Em camundongos, a ausência da proteína AIRE influencia a expressão ectópica de PTAs em células mTEC e no aparecimento de um distúrbio autoimune semelhante a síndrome APS-1. Os resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram que além do controle da expressão de mRNAs de PTAs, o gene Aire também participa da modulação de miRNAs e lncRNAs em mTECs. Neste trabalho foi usado o sistema CRISPR-Cas9 para a indução de uma mutação no domínio SAND de Aire (mutação del3554G clone CS8D6) em células mTECs murinas. Nosso objetivo principal foi avaliar por sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) o efeito dessa mutação no fenótipo das populações de células mTECs e na regulação transcricional de RNAs longos não codificadores (lncRNAs em células mTEC). A mutação del3554G afetou a expressão de diversos mRNAs e lncRNAs, incluindo aqueles envolvidos na adesão celular e na regulação da transcrição. O enriquecimento biológico mostrou um impacto dessa mutação em processos biológicos como ativação de células T e diferenciação de linfócitos. Uma rede de interação entre lncRNAs e mRNAs revelou conexões entre esses RNAs essenciais para o desenvolvimento, proliferação, adesão e migração celular. Esses achados contribuem para o conhecimento sobre a atuação dos lncRNAs nas células mTECs e o papel do gene Aire na tolerância imunológica central, abrindo novas perspectivas para futuras investigações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na autoimunidade.
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Mais de 100 mutações de Aire já foram descritas incluindo mutações pontuais até grandes deleções na sequência codificadora. Mutações de Aire estão associadas ao aparecimento de doenças autoimunes sendo a síndrome poliendocrinopatia autoimune do tipo 1 (APS-1) a mais frequente. A sequência nucleotídica de Aire é altamente conservada entre humanos e camundongos. Em camundongos, a ausência da proteína AIRE influencia a expressão ectópica de PTAs em células mTEC e no aparecimento de um distúrbio autoimune semelhante a síndrome APS-1. Os resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram que além do controle da expressão de mRNAs de PTAs, o gene Aire também participa da modulação de miRNAs e lncRNAs em mTECs. Neste trabalho foi usado o sistema CRISPR-Cas9 para a indução de uma mutação no domínio SAND de Aire (mutação del3554G clone CS8D6) em células mTECs murinas. 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Esses achados contribuem para o conhecimento sobre a atuação dos lncRNAs nas células mTECs e o papel do gene Aire na tolerância imunológica central, abrindo novas perspectivas para futuras investigações sobre os mecanismos moleculares envolvidos na autoimunidade.The autoimmune regulator gene (Aire), a non-classical transcription factor in medullary thymic epithelial cells (mTECs), plays a crucial role in regulating the expression of peripheral tissue antigen (PTA) genes essential for central immune tolerance. Over 100 Aire mutations have been described, ranging from point mutations to large deletions in the coding sequence. Aire mutations are associated with the onset of autoimmune diseases, the most common being autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1 (APS-1). The nucleotide sequence of Aire is highly conserved between humans and mice. In mice, the absence of the AIRE protein influences the ectopic expression of PTAs in mTECs and the development of an autoimmune disorder like APS-1. Previous results from our laboratory have shown that in addition to controlling the expression of PTA mRNAs, the Aire gene also participates in the modulation of miRNAs and lncRNAs in mTECs. In this study, the CRISPR-Cas9 system was used to induce a mutation in the Aire SAND domain (del3554G mutation, clone CS8D6) in murine mTECs. Our main objective was to evaluate, by single-cell RNA sequencing (scRNA-seq), the effect of this mutation on the phenotype of mTEC populations and the transcriptional regulation of long non-coding RNAs (lncRNAs) in mTECs. The del3554G mutation affected the expression of several mRNAs and lncRNAs, including those involved in cell adhesion and transcriptional regulation. Biological enrichment analysis showed an impact of this mutation on biological processes such as T cell activation and lymphocyte differentiation. An interaction network between lncRNAs and mRNAs revealed connections between these RNAs essential for cell development, proliferation, adhesion, and migration. These findings contribute to the understanding of the role of lncRNAs in mTECs and the role of the Aire gene in central immune tolerance, opening new perspectives for future investigations on the molecular mechanisms involved in autoimmunity.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPPassos Junior, Geraldo Aleixo da SilvaDuarte, Max Jordan de Souza2024-12-17info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-04042025-170715/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2025-07-22T20:01:02Zoai:teses.usp.br:tde-04042025-170715Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212025-07-22T20:01:02Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
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