Efeitos dos domínios hinge-transmembrana e transdução de sinal de GXMR-CAR na indução da ativação de células T e NK frente ao Cryptococcus spp.

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Santos, Matheus Henrique dos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Células NK-92; Células T; Chimeric antigen receptor; Cryptococcus spp.; GXMR-CAR; Infecções fúngicas invasivas; Invasive fungal infections; NK-92 cells; Receptor antigênico quimérico; T cells
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-08112022-174507/

As infecções fúngicas invasivas (IFIs) representam um sério problema de saúde pública. Dentre as doenças negligenciadas, as IFIs apresentam taxas de mortalidade em patamares semelhantes aos ocasionados pela malária ou tuberculose. A criptococose, manifestação da infecção causada por Cryptoccocus spp., é responsável por cerca de 180.000 mortes anuais globalmente. O comprometimento do sistema imune é o maior fator de risco para o estabelecimento da infecção, e as espécies Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são as de maior relevância clínica, podendo acometer tanto indivíduos imunocomprometidos quanto imunocompetentes. Esses patógenos apresentam um diverso arsenal de fatores de virulência e mecanismos de escape/subversão da resposta imunológica do hospedeiro, seja impedindo ou sobrevivendo à fagocitose, ou comprometendo a diferenciação e atuação de subtipos de células T importantes no controle da infecção. Para contornar esse processo, a presente dissertação avaliou o redirecionamento de células T e natural killer (NK) para o reconhecimento de Cryptoccocus spp. via interação com o polissacarídeo glucuronoxilomanana (GXM) presente na cápsula desse patógeno. Para isso, o receptor antigênico quimérico (CAR) com capacidade de reconhecer GXM, denominado GXMCAR, foi expresso em células T e NK através da transdução com partículas lentivirais. O redirecionamento e efeitos funcionais desencadeado por diferentes GXMR-CAR foi avaliado frente a Cryptococcus spp., sendo considerado os receptores caracterizados pelas seguintes diferenças estruturais: porções hinge-transmembrana, com IgG4-hinge e CD28-transmembrana, GXMR-IgG4-28ζ; hinge-transmembrana contendo CD8α acoplado com domínio de transdução de sinal 4-1BB ou CD28, GXMR-8-BBζ e GXMR-8-28ζ, respectivamente. Células Jurkat foram adotadas como plataforma de expressão de GXMR-CAR e de avaliação frente a C. gattii R265, C. neoformans H99 ou isolados clínicos. Células da linhagem NK-92 foram consideradas na expressão de GXMR-CAR para avaliar o controle da infecção in vitro por Cryptococcus spp. A modificação de células Jurkat com GXMR-CAR demonstrou uma maior expressão dos construtos contendo CD8α como hinge-transmembrana. A expressão de GXMR-8-BBζ ou GXMR8-28ζ propiciou melhor taxa de expansão celular comparado com as células expressando GXMR-IgG4-28ζ. A modificação com GXMR-CAR contendo CD8α como hinge/transmembrana induziu a sinalização tônica em células Jurkat, e a molécula coestimulatória 4-1BB desencadeou os maiores níveis de produção de IL-2 em comparação com CD28. Mesmo na presença da sinalização tônica, GXMR-8-BBζ ou GXMR-8-28ζ induziram um aumento significativo nos níveis de IL-2 após a incubação com GXM solúvel ou leveduras inativadas de Cryptococcus spp, enquanto a expressão de GXMRIgG4-28ζ não induziu a ativação das células. A inibição da via de sinalização do GXMRCAR com o fármaco dasatinibe, inibidor de tirosina quinases da família Src, atenuou a sinalização tônica mediada por GXMR-8-137z e GXMR-8-28z. Além disso, as células modificadas com GXMR-CAR tiveram redução da taxa proliferativa após a incubação com as leveduras inativadas, fato atenuada com a adição de dasatinibe no cultivo celular. Em complemento, células Jurkat transduzidas com GXMR-8-BBζ ou GXMR-8-28ζ são capazes de reconhecerem diferentes sorotipos de C. gattii e C. neoformans derivados de isolados clínicos, e isso resultou na ativação celular. A expressão dos diferentes GXMRCAR na linhagem celular NK-92 demonstrou maiores taxas de expressão dos construtos contendo CD8α como hinge-transmembrana, com a frequência de células modificadas com GXMR-CAR se mantendo relativamente estável por prolongados períodos de cultivo. A atividade fungicida das células NK-92 modificadas com GXMR-8-BBζ foi avaliada frente ao Cryptococcus spp., e o co-cultivo das células com as leveduras resultou na produção de elevados níveis de INF-γ, além disso, a expressão de GXMR-8-BBζ medeia a sinalização tônica de células NK-92. Essas células foram capazes de aumentarem a susceptibilidade de Cryptococcus spp. frente a anfotericina B, enquanto o efeito fungicida e fungistático não foi alcançado. Em conclusão, a caracterização de distintos construtos de GXMR-CAR frente ao ligante, em diferentes tipos celulares, elencou os domínios de GXMR-CAR que resultaram em melhor funcionalidade do receptor na presença de Cryptococcus spp.