Estudo do catabolismo de propionato em mutantes prp de Burkholderia sacchari relacionado à produção de Poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) usando xilose e propionato.

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Véras, Franz Wagner Laurett
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: α-oxidação de propionato; Burkholderia sacchari; catabolismo de propionato; polihidroxialcanoato; Poly-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato 3HB-co-3HV; Poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate3HB-co3HV; polyhydroxyalkanoate; propionate α-oxidation; propionate catabolism
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-10052024-120022/

Burkholderia sacchari, uma bactéria Gram-negativa não patogênica isolada do solo no Brasil, é capaz de utilizar carboidratos acumulando até 75% da biomassa seca de células como grânulos de poli-hidroxialcanoatos (PHA). PHA são poliésteres biodegradáveis e biocompatíveis, amplamente estudados por seu grande potencial para as indústrias farmacêutica e biotecnológica. Quando cultivada sob excesso de fonte de carbono, com limitação de um nutriente essencial (como fósforo ou nitrogênio), Burkholderia sacchari promove um acúmulo expressivo do homopolímero poli-3-hidroxibutirato (P(3HB) e, se fornecido propionato, acumula o copolímero poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato [P(3HB-co-3HV)], que é mais maleável e com maiores aplicações. Apesar das vantagens deste material, o preço elevado do propionato como substrato e a baixa conversão para 3HV representam obstáculos à competitividade deste material no mercado. A baixa conversão natural em 3HV é atribuída à presença de pelo menos duas vias catabólicas de propionato: αoxidação e 2-metilcitrato (2MCC), que preferencialmente o convertem em biomassa, CO2 e H2O. Dentre estas duas vias, apenas a 2MCC foi descrita, enquanto a via de α-oxidação permanece indicada apenas por evidências fenotípicas. O mutante UV LFM177, deficiente no uso de propionato e intermediários da αoxidação para seu crescimento, foi utilizado para estudar os impactos desta via na produção de P(3HB-co-3HV). Foram realizados cultivos em frascos agitados, com xilose (∼15 g/L) e diferentes concentrações de propionato (0,12 a 1,75 g/L) fornecidas durante a fase de acúmulo de PHA. O maior valor do fator de conversão de propionato a 3HV (Y3HV/Prop) obtido foi de 0,49 g/g em LFM177, enquanto em LFM101 (controle) de 0,35 g/g, ambos sob concentrações mais baixas (próximas de 0,12 g/L). O mutante LFM177 foi avaliado sob condições controladas em biorreator, empregando diferentes estratégias de alimentação, possibilitando a obtenção de dados cinéticos, seja apenas com xilose (∼15 g/L) ou xilose (∼10 g/L) e propionato (0,03 a 2,7 g/L). Frente a maiores concentrações de propionato (1,7 e 2,7 g/L), o mutante LFM019 (afetado em 2MCC) foi utilizado como controle, mostrando efeitos inibitórios imediatos, enquanto no mutante LFM177 houve um ativo consumo, aumentando o teor 3HV (mol%) conforme mais propionato fosse suprido. A última etapa do presente trabalho teve foco em buscar evidências moleculares sobre esta via da α-oxidação. A partir de um banco de mutantes de B. sacchari afetados pela ferramenta pBAMD-1,2 (baseada em mini-Tn5), a qual se insere de forma aleatória no cromossomo bacteriano, era esperada a obtenção de clones com diversos fenótipos. Por meio de screening em meio mineral com uma única fonte de carbono (xilose, sacarose, glicose, propionato, acetato, lactato ou piruvato) foram encontrados mutantes fenotipicamente semelhantes a LFM177 quanto ao uso de propionato. Através desta estratégia, foi possível amplificar e sequenciar regiões adjacentes ao local de inserção de pBAMD-1,2, trazendo uma nova possibilidade de encontrar genes relacionados a putativa via da α-oxidação.