Investigação das bases genéticas e epigenéticas de osteossarcomas

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Pires, Sara Ferreira
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: DNMT3B; Expressão gênica; Gene expression; Genoma; Genome; Methylome; Metiloma; Osteosarcoma; Osteossarcoma; ZFHX4
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-24012025-153947/

INTRODUÇÃO: Cânceres pediátricos são a principal causa de mortalidade por doença nessa faixa etária, no Brasil e no mundo. Os tumores ósseos primários correspondem a cerca de 3% de todos os tumores da infância e adolescência, sendo osteossarcoma o mais prevalente. Osteossarcomas têm curso clínico agressivo, alta propensão à metástase ao diagnóstico e genomas instáveis e complexos. Apresentam extensa heterogeneidade intertumoral, taxa de mutação superior à maioria dos tumores pediátricos e poucas mutações recorrentes que expliquem sua iniciação, progressão e desfechos clínicos. Neste contexto, o estudo de osteossarcomas continua a ter relevância científica e clínica significativa, com o objetivo de aprofundar a compreensão das vias biológicas subjacentes a essa doença e, potencialmente, aplicar as descobertas ao diagnóstico e tratamento. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi investigar o perfil genético e epigenético de 28 osteossarcomas primários derivados de pacientes brasileiros, majoritariamente diagnosticados na fase infanto-juvenil, para identificar genes e vias biológicas recorrentemente alterados, com potencial relevância para o desenvolvimento e progressão tumoral. MATERIAIS E MÉTODOS: Para acessar o catálogo completo de alterações genéticas, incluindo mutações de ponto (SNVs single nucleotide variants, e indels pequenas inserções e deleções) e alterações de número de cópias (CNAs copy number alterations), utilizamos painel de 4.800 genes (TruSight One, Illumina) em sequenciamento de nova geração de amostras de DNA de 28 osteossarcomas. Para investigação de alterações epigenéticas (padrão de metilação de DNA), utilizamos microarranjo de metilação HM450K (Illumina), comparando amostras de DNA de 28 osteossarcomas com tecido ósseo não tumoral (n = 3). Posteriormente, a partir da lista de genes afetados por alterações genômicas e epigenéticas, realizamos análises in silico de enriquecimento funcional (vias e processos biológicos) e análise de interação proteína-proteína (PPI). Selecionamos um subgrupo de genes de interesse que emergiram dessas análises para quantificação de expressão gênica utilizando PCR quantitativa em tempo real (RTqPCR), comparando amostras de cDNA de osteossarcomas (n = 11), linhagens celulares de osteossarcoma (n = 3) e amostras de tecido ósseo não tumoral (n = 3). Além disso, exploramos possíveis relações entre as alterações identificadas e características clínicas dos pacientes, como presença de metástase e estado de óbito. RESULTADOS: Identificamos em osteossarcomas um conjunto de alterações envolvendo 445 variantes codificadoras do tipo SNV/indel e 1.176 CNAs, bem como 585 loci com metilação diferencial em relação a amostras ósseas não tumorais. As alterações genéticas e epigenéticas se apresentaram amplamente distribuídas por todo o genoma dos tumores, com número e padrão variável entre as amostras, evidenciando heterogeneidade e complexidade. Oitenta alterações do tipo SNV/indel foram selecionadas como provavelmente mais prejudiciais à função da proteína, incluindo mutações em genes relevantes em câncer e em predisposição a câncer, como ATRX, RB1 e TP53, e outros genes supressores tumorais e oncogenes, como AXL, CREBBP e SETD2. Genes não comumente reportados em estudos com osteossarcomas foram também observados como mutados, como ACADM, ADH7 e G6PC2. Alterações em genes como DMD, KNL1 e ZFHX4 foram prevalentes em pacientes com metástase ao diagnóstico ou que vieram a óbito em decorrência do câncer, sendo potencialmente indicativas de pior prognóstico. Cinco variantes em RB1 e TP53 foram classificadas como possivelmente germinativas, conforme as diretrizes da European Society for Medical Oncology (ESMO) para análise de amostras tumorais não pareadas com germinativas; parte destes casos foi relacionado ao perfil genômico global diferenciado, incluindo número total de alterações aumentado em relação ao grupo e presença de rearranjos cromossômicos complexos. Cinco alterações do tipo CNA foram as mais recorrentes (>60% da coorte), incluindo ganhos em 1q, 6p, 8q, e perdas em 10q e 13. Também identificamos padrão genômico de CNA sugestivo da ocorrência de rearranjos complexos (cromotripse e cromoanassíntese) em 25% da coorte. A análise de metiloma revelou um padrão de hipometilação global do genoma em osteossarcomas, com enriquecimento de hipermetilação em ilhas CpG. Identificamos diversos genes supressores tumorais mapeados em regiões com hipermetilação, como HIC1, PAX6 e ZIC1, e oncogenes em regiões com hipometilação, como NANOG, NOTCH4 e RUNX3. Relacionamos os achados epigenéticos, especialmente o padrão de hipermetilação preferencial em ilhas CpG, a alterações genômicas recorrentes em moduladores epigenéticos, especialmente ganhos envolvendo DNMT3B e deleções envolvendo TET1. Os principais módulos funcionais (vias e processos biológicos) enriquecidos foram relacionados à regulação do ciclo celular, resposta imune, resposta ao estresse, desenvolvimento, diferenciação celular, metabolismo e regulação da expressão gênica. Selecionamos quatro genes (DNMT3B, KNL1, TNFRSF11B e ZFHX4) para validação do impacto dos achados prévios de genoma e epigenoma no nível de expressão; estes genes são envolvidos em regulação dos padrões de metilação de DNA, ciclo celular, regulação transcricional ou desenvolvimento do sistema esquelético. Detectamos aumento de expressão de todos os genes avaliados em osteossarcomas e linhagens celulares em comparação aos controles de tecido ósseo não tumoral. TNFRSF11B e ZFHX4 se destacaram com maiores aumentos de expressão. O gene ZFHX4 é apresentado como um gene candidato promissor à osteossarcomagênese e/ou progressão, com perspectivas futuras para fortalecer essa hipótese. CONTRIBUIÇÕES: A caracterização genômica e epigenômica apresentada neste trabalho contribui com dados inéditos e fornece uma nova perspectiva para entendimento das bases moleculares de osteossarcomas. Os resultados obtidos, a maior parte apresentada em dois artigos científicos publicados em periódicos internacionais, abrem caminho para investigações futuras, com foco em genes candidatos ainda pouco explorados na etiologia da doença. Por fim, foram produzidos materiais de divulgação científica e ensino em genética do câncer pediátrico, com o objetivo de disseminar o conhecimento sobre o tema na comunidade não universitária.