Função da ADP-ribosilação em resposta à inibição do lisossomo

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Duré, Dulce María González
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: ADP-ribosilação; ADP-ribosylation; Autofagia; Autophagy; Chloroquine; Cloroquina; Mitochondria; Mitocôndria; PARP3
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-13062025-113317/

A ADP-ribosilação é uma modificação pós-traducional caracterizada pela transferência de uma ou mais unidades de ADP-ribose, a partir de NAD+, para resíduos específicos de aminoácidos em proteínas-alvo. Essa reação é catalisada por enzimas da família das ADP-ribosiltransferases, em particular um subgrupo destas denominado PARPs. Até o momento, foram identificadas 17 PARPs envolvidas em diversos processos celulares, como reparo de DNA, sinalização celular, biossíntese proteica, morte celular e resposta antiviral. Algumas PARPs têm sido implicadas na via de autofagia, por ADP-ribosilar ou interagir com componentes essenciais dessa via. Contudo, o papel molecular exato da ADP-ribosilação de proteínas durante a autofagia permanece pouco elucidado. Nosso grupo observou que a cloroquina (CQ), um agente lisossomotrópico que bloqueia a autofagia ao neutralizar o pH lisossomal, promove um aumento significativo nos níveis de ADP-ribosilação no citoplasma de células humanas tratadas. Dessa forma, este estudo investigou o papel da ADP-ribosilação em resposta à inibição lisossomal induzida por agentes lisossomotrópicos. Utilizando abordagens como mini-screen de siRNAs direcionados às PARPs, células knockout e inibidores específicos, identificamos que essa ADP-ribosilação é mediada por PARP3. Ensaios de imunofluorescência revelaram que o sinal de ADP-ribose, de maneira geral, não co-localiza com autofagossomos ou autolisossomos, mas co-localiza amplamente com a rede mitocondrial. Além disso, uma análise cinética demonstrou que a ADP-ribosilação induzida pela CQ ocorre a partir de 2 horas de tratamento e permanece constante até 24 horas, enquanto os níveis de LC3 II e p62 aumentam gradativamente ao longo do tempo, sugerindo que a ADP-ribosilação detectada aqui não marca substratos de degradação por autofagia. Embora um dos objetivos iniciais fosse identificar as proteínas-alvo dessa ADP-ribosilação, verificou-se que o reagente α-ADP-ribose (HCA354) utilizado na maioria dos ensaios de imunofluorescência também detecta NADH crosslinkado a proteínas devido ao crosslinking promovido pelo paraformaldeío (PFA) 4% durante a fixação. Assim, parte deste estudo focou na caracterização da especificidade de diferentes reagentes α-ADP-ribose. Comparações entre fixações com PFA 4% e Metanol:acetona (MeOH:Ac) e a utilização de 5 reagentes α-ADP-ribose diferentes, que detectam ou não NADH crosslinkado, demonstraram que o sinal de ADP-ribose varia conforme o método de fixação e os reagentes utilizados. No entanto, os resultados obtidos com ambos os métodos de fixação demonstraram que o sinal de ADP-ribose observado após o tratamento com CQ de fato reflete ADP-ribosilação modulada principalmente por PARP3 e que CQ não altera a razão NAD+/NADH mitocondrial. Em conjunto, este estudo sugere uma nova função de PARP3 em resposta à inibição da autofagia, na qual proteínas mitocondriais são potenciais alvos dessa ADP-ribosilação, possivelmente como consequência da disfunção mitocondrial.