Investigação do processo de reconhecimento molecular da crotoxina em macrófagos:avaliação da interação toxina-bicamada e receptores peptídeo formil.

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Pimenta, Luciana de Araujo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Crotoxin; Crotoxina; Estudo Termo-Estrutural; Formyl Peptide Receptors; Immunomodulation; Imunomodulação; Macrófagos; Macrophages; Receptores Peptídeo Formil; Thermostructural Study
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42136/tde-08032022-161121/

Vários estudos têm demonstrado que a Crotoxina (CTX), principal toxina do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus, possui ações antitumoral, anti-inflamatória, antiviral e imunomoduladora em modelos in vivo e in vitro. Em macrófagos, atividades biológicas, como crescimento, diferenciação, ativação, reconhecimento, endocitose, migração e secreção são processos relacionados à sinalização mediada por receptores expressos na superfície da membrana dessas células. Em relação às atividades imunomoduladoras, a CTX estimula, em particular, o metabolismo energético dos macrófagos e a produção de citocinas e Lipoxina A4 (LXA4) e seu análogo estável 15-Epi-LXA4 (15-Epi-LXA4), mediadores lipídicos com potente efeito imunomodulador. Sobre diferentes processos fisiopatológicos, estas ações da CTX são bloqueadas em sua totalidade por Boc-2, um antagonista do receptor peptídeo formil peptídeo (FPR). Além dos FPRs, essas atividades biológicas também envolvem processos como abertura e fechamento de canais iônicos, geração de curvatura de membrana e formação de poros. Apesar dessas evidências, ainda não se sabe se os FPRs estariam envolvidos e se também participam da entrada da toxina nos macrófagos, e ainda, de que forma esta toxina interage com diferentes moléculas da membrana. No presente estudo, foi investigado se o silenciamento dos FPRs 1 e 2 nos monócitos THP-1 ou macrófagos THP-1 poderia comprometer a entrada da CTX, por meio da técnica de nucleofecção para o silenciamento e imunofluorecências para observação da entrada da toxina nas células utilizando ou não inibidores como Boc-2 (FPRs 1 e 2). Foram realizados ensaios para avaliar atividade biológica como dosagem de peróxido, espraiamento, fagocitose e técnica de western blotting. Em ensaios termo-estruturais, foram utilizados lipídio neutro, como DPPC e aniônicos, como DPPG e DPPS que são mais abundantes na membrana celular dos macrófagos e técnicas como DSC, EPR e vazamento de carboxifluoresceína. Dos resultados, tanto a técnica de silenciamento de siRNA de FPR-1, bem como o ensaio farmacológico, usando Boc-2 (FPRs 1 e 2) demonstrou claramente a participação crucial de FPRs 1 e 2 e sua interação com a cascata de sinalização a jusante para tirosina quinase em ações imunomoduladoras da CTX sobre as funções de macrófagos humanos. Por outro lado, os FPRs não estão envolvidos com a entrada na toxina em macrófagos humanos, sugerindo que esses receptores são fundamentais para acionar as ações parácrinas e autócrinas de LXA4 e seu análogo 15-Epi-LXA4 induzidas por CTX em macrófagos. Foi demonstrado também que CTX pode além de penetrar nas células THP-1, induzir poros apenas nas membranas lipídicas aniônicas, em especial vesículas compostas por DPPS. Considerando que a seletividade da composição lipídica varia em diferentes tecidos e órgãos do corpo humano, os estudos termoestruturais aqui apresentados são extremamente importantes para abrir novas investigações sobre as atividades biológicas descritas para CTX em diferentes sistemas biológicos reais.