Mutações no gene autoimmune regulator (Aire) no exon 6 (domínio SAND) e no exon 8 (domínio PHD1) alteram o transcriptoma e as funções das células tímicas epiteliais medulares

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Tanaka, Pedro Paranhos
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Aire gene; Autoimmune; Autoimmune polyglandular syndrome type 1 (APS1); Célula tímica epitelial medular (mTEC); CRISPR/Cas9; Gene aire; Medullary thymic epithelial cell (mTEC); Polyglandular Syndrome Type 1 (APS1); Single-cell RNA sequencing
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-25092024-103848/

O gene Autoimmune Regulator (Aire) é essencial para o desenvolvimento das células tímicas epiteliais medulares (mTECs) e possui um papel fundamental na eliminação de timócitos potencialmente autoreativos no processo da seleção negativa, o que garante o estabelecimento da tolerância imunológica central. Aire é o principal regulador da expressão gênica promiscua (PGE) nas mTECs, atuando como um fator de transcrição não clássico e promovendo a expressão de milhares de antígenos restritos à tecidos (TRAs). A PGE garante a representatividade no timo de virtualmente todos os tecidos do corpo durante a seleção negativa. Além de promover a expressão de genes que codificam TRAs Aire tem um papel importante em diversos processos biológicos nas mTECs. Mutações no gene Aire podem levar ao desenvolvimento da Autoimmune Polyglandular Syndrome Type 1 (APS1), uma doença autoimune sistêmica rara que traz consequências devastadoras para os pacientes. A APS1 foi originalmente classificada como uma síndrome autossômica de herança recessiva, porém nos últimos anos diversas versões dominantes foram descritas em pacientes. Nesse trabalho nós utilizamos o sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações indel em células mTEC 3.10 num sistema in vitro. Nós identificamos diversas células mutantes, incluindo o clone mutante CS8D6 carregando a mutação c.735delG em heterozigose. Por meio da técnica de scRNA-seq nós comparamos a população mutante com a população wild-type (WT) e identificamos alterações na heterogeneidade da população mutante, além de identificar a modulação de milhares de genes, incluindo genes de TRAs e genes associados à apresentação de antígenos, alterações no citoesqueleto de actina, migração celular e adesão célula-célula. Nós identificamos os padrões de expressão desses genes dentre as subpopulações WT e mutante, e observamos que parte da população mutante apresenta uma descaracterização com a linhagem de mTEC e uma redução drástica na expressão de todos esses genes. Através da transdução por lentivírus nós também obtivemos células mTEC 3.10 com uma expressão estável das versões p.G229W e p.C313Y da proteína AIRE, que correspondem, no modelo murino, a mutações dominantes descritas em pacientes com APS1. Nós realizamos ensaios funcionais com as células transduzidas baseado em processos biológicos identificados na análise de scRNAseq. A mutação p.G229W leva a uma redução na indução da migração de timócitos similar à mutação recessiva, enquanto a mutação p.C313Y aumenta adesão mTECtimócitos, em relação à todas as outras versões de AIRE. A análise morfológica indicou também que as mutações, afetam a morfologia das mTECs, e a mutação p.G229W e recessiva alteram a interação mTEC-mTEC. Em conjunto esses resultados contribuem para melhor compreensão dos mecanismos de Aire nas mTECs, mostrando que mutações nesse gene afetam a heterogeneidade da população de mTECs, alterando o transcriptoma das diferentes subpopulações, e que diferentes mutações trazem consequências funcionais distintas.