Produção de Proteínas Recombinantes de SARS-CoV-2 e Utilização para Detecção de Anticorpos em Pacientes Convalescentes

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Barbosa, Ana Paula
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: citocinas; COVID-19; cytokines; ELISA; Nucleocapsid; Nucleocapsídeo; Western Blotting
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-16072024-151947/

A crise global resultante da pandemia de COVID-19 oportunizou diversas lições para o enfrentamento das próximas pandemias. A testagem em massa de indivíduos suspeitos é uma importante ferramenta para a diminuição da transmissibilidade viral, visto que possibilita o isolamento social precoce de indivíduos infectados. A proteína do nucleocapsídeo de SARS-CoV-2, vírus causador da COVID-19, apresentou ótimo desempenho em ensaios sorológicos de detecção anticorpos em pacientes convalescentes, o que auxiliou a mapear indivíduos infectados assintomáticos ou com sintomas tardios. Os testes sorológicos permitiram a identificação de indivíduos infectados antes da vacinação, inclusive em lugares onde a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) não era praticada, o que interferiu na elaboração de medidas de saúde pública. Somado a isso, sabe-se que os piores prognósticos da COVID-19 estão relacionados à reação inflamatória exacerbada, causada pela produção e liberação excessiva, aguda e descontrolada de sinalizadores pró-inflamatórios, como as interleucinas IL-1, IL-6, IL-17 e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), que causam dano no epitélio respiratório. As proteínas virais produzidas na célula infectada parecem interferir na resposta imune do hospedeiro, inibindo mecanismos inatos de defesa e regulação da resposta inflamatória. A produção de proteínas recombinantes de SARS-CoV-2 podem viabilizar o desenvolvimento de testes sorológicos com maior sensibilidade e especificidade além auxiliar a elucidar os mecanismos de liberação de citocinas inflamatórias em estudos in vitro. Este trabalho iniciou-se com o desenho de variadas construções para produção de proteínas recombinantes de SARS-CoV-2 para inferir a imunogenicidade através da avaliação da capacidade de detecção de anticorpos no soro de pacientes convalescentes de COVID-19 pelas metodologias de Western Blotting e ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). As proteínas recombinantes solúveis produzidas foram 3CLpro, Nsp8, Nucleocapsídeo e seus fragmentos N e C-terminal. Destas, apenas a proteína Nucleocapsídeo e seus fragmentos apresentaram resultados relevantes na detecção de anticorpos no soro de pacientes convalescentes de COVID-19 por Western Blotting e ELISA, com destaque para a sensibilidade e especificidade resultante pelo último método para a proteína inteira (98% e 95%, respectivamente). As proteínas recombinantes 3CLpro, Nsp8, Nucleocapsídeo também foram incubadas em cultura de macrófagos para avaliação da liberação de TNF-alfa, IL-1, e IL-17 relacionadas à tempestade de citocinas observadas em pacientes graves de COVID-19. Esta análise foi prejudicada devido à presença de endotoxinas bacterianas nas proteínas recombinantes em questão, o que poderia interferir nos resultados obtidos, sendo necessária a implementação de novos processos de purificação antes de novos ensaios.