Otimização de tecnologia de sequenciamento nanopore para detecção rápida de genes de resistência a β-lactâmicos de importância clínica

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Souza, Gabrielle Messias de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: β-lactamases; βlactamases; Diagnosis; Diagnóstico; Microbiota; Nanopore sequencing; Sequenciamento nanopore
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-25092024-091148/

Atualmente uma crise médica global se desenrola à medida que antibióticos perdem a sua eficácia contra o número crescente de bactérias multirresistentes. Sem a introdução de novos quimioterápicos no mercado, a resistência a antibióticos é uma ameaça que resulta em consequências críticas na terapêutica médica, economia e nas taxas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. O emprego exacerbado de antibióticos entrementes a pandemia de COVID-19 pode aumentar o impacto da situação alarmante vigente das terapias de infecções bacterianas. Abordagens metagenômicas são métodos independentes de cultura que permitem ampla investigação do resistoma contornando desvantagens oferecidas por métodos convencionais, possibilitando a identificação dos genes de resistência de forma rápida e viável.O sequenciamento por nanopore apresenta inúmeras vantagens como a facilidade do manejo e transporte do aparelho, fácil e rápida preparação da amostra, retorno rápido em temporeal da análise dos dados e baixo custo, podendo atuar no rápido diagnóstico como também no monitoramento da microbiota humana para identificação precoce do resistoma bacteriano. Dado o contexto, o objetivo do presente estudo foi otimizar ferramenta para detecção de genes de resistência antimicrobiana, utilizando tecnologia de sequenciamento de nanopore MinION. A primeira etapa do estudo envolveu a padronização de nove reações distintas de PCR multiplex para detecção de genes relevantes de resistência aos β-lactâmicos, conforme indicado pela presença de bandas em gel de agarose a 1,5%. Posteriormente, essas nove reações foram consolidadas em duas reações baseadas na determinação das concentrações ideais de primers e na identificação de gradientes e ciclos de temperatura comuns. Em seguida, para validação, foram criados ambientes metagenômicos artificiais para simular cenários com alta prevalência de genes de resistência, bem como ambientes com mínima ou nenhuma presença dos genes. Os produtos dessas reações de PCR no ambiente metagenômico sintético foram submetidos ao sequenciamento Nanopore por alvo usando um sequenciador MinION. Após análise dos dados, concluiu-se que a otimização permitiu padronizar o uso da tecnologia de sequenciamento nanoporo por alvo com potencial detecção de 101 genes de resistência aos β-lactâmicos em no mínimo 8 horas e 30 minutos e no máximo 12 horas. Isto representa uma redução significativa no tempo necessário para a detecção, em contraste com as 48 a 72 horas necessárias aos método de cultura tradicional utilizado nas clínicas para os resultados. Em bora ainda sejam necessárias análises adicionais para explorar o potencial desta estratégia, o estudo produziu uma prova de conceito utilizando de tecnologia de sequenciamento que, além de procedimento otimizado, possui uma ampla gama de aplicações clínicas, garantindo amplos benefícios. Ao validar técnica que garante a rápida detecção de genes de resistência a antimicrobianos, a prova de conceito tem potencial para melhorar o diagnóstico clínico e o monitoramento da resistência, contribuindo para melhores prognósticos, propostas de políticas e respostas de prevenção para o controle de infecções causadas por microrganismos multirresistentes.