Análise de interatores da proteína Orc1/Cdc6 de Trypanosoma cruzi.

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Lima, Loyze Paola Oliveira de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Trypanosoma cruzi; DNA polymerase theta; DNA replication; Orc1/Cdc6; Orc1/Cdc6, DNA polimerase theta,; Replicação do DNA
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42135/tde-04052023-180819/

Aproximadamente dez milhões de pessoas, predominantemente na América Latina, são acometidas pela doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi. Apesar disso, essa enfermidade apresenta investimentos reduzidos em pesquisas e produção de medicamentos. As drogas atualmente disponíveis para tratar essa doença têm efeitos tóxicos e não são eficazes contra todas as fases da doença ou cepas de parasitas, tornando necessário estudos que apresentem alvos terapêuticos específicos. Nesse contexto, nosso laboratório estuda a replicação do DNA em Trypanosoma, uma vez que caracterizar a replicação deste parasita pode servir como uma ferramenta para buscar possíveis alvos terapêuticos. Neste estudo, investigamos o papel da proteína DNA Polimerase theta-domínio helicase (Pol-helicase) na replicação do T. cruzi. A DNA polimerase theta (Pol) de eucariontes recentes é um membro da família de polimerase e exibe um domínio C-terminal da polimerase, um domínio central e um domínio de helicase N-terminal. A proteína Pol desempenha importantes papéis no reparo do DNA através de seu domínio polimerase, regulando a integridade do genoma. Além disso, em mamíferos, a Pol modula o tempo de disparo da origem e o recrutamento da helicase MCM para a cromatina. Em contraste, o genoma de T. cruzi exibe dois ortólogos putativos individuais de Pol em diferentes locos do genoma; um homólogo ao domínio da polimerase do terminal C de Pol e o outro homólogo ao domínio da helicase, denominado Pol-polimerase e Pol-helicase, respectivamente. Neste estudo, um ensaio de pull-down usando o componente T. cruzi do complexo de pré-replicação Orc1/Cdc6 como isca capturou Pol-helicase do extrato nuclear. Orc1/Cdc6 e Pol-helicase interagiram diretamente e a Pol-helicase recombinante apresentou atividade de desenrolamento do DNA e de ATPase. Além disso, uma cepa de T. cruzi superexpressando o domínio Pol-helicase exibiu uma quantidade significativamente menor de MCM7 ligado ao DNA e prejudicou o disparo na origem da replicação. Utilizamos a metodologia de CRISPR-Cas9 para gerar uma linhagem que expressa a Pol-helicase sem o domínio de helicase, observamos que essa linhagem, de fato, apresentou mais MCM no DNA. Em conjunto, esses dados sugerem que a Pol-helicase modula a replicação do DNA interagindo diretamente com Orc1/Cdc6, o que reduz a ligação do MCM7 ao DNA e, assim, prejudica o disparo das origens de replicação.