Desenvolvimento de fases biocompatíveis para microextração em fase sólida e aplicações de suas variantes in-tube e in vivo na determinação de biomarcadores de doenças neurodegenerativas por LC-MS/MS

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Oliveira, Igor Gustavo de Carvalho
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: in vivo SPME; in-tube SPME; Biomarcadores; Biomarkers; Carbon nanotubes; Doenças neurodegenerativas; Endocanabinóides; Endocannabinoids; Homocisteína; Homocysteine; Microextração em fase sólida; Nanotubos de carbono; Neurodegenerative diseases; Solid-phase microextraction
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-05062025-111055/

A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) tem sido a técnica analítica de referência para a determinação de biomarcadores de doenças neurodegenerativas, como o Parkinson (DP) e Alzheimer (DA), em amostras biológicas. Entretanto, dada a complexidade dessas amostras, a etapa de preparo de amostras é requerida. Nesse contexto, destacam-se a microextração em fase sólida (SPME) e suas variantes in-tube SPME e in vivo SPME, como técnicas não-exaustivas de preparo de amostras que integram a amostragem, extração e pré-concentração em uma única etapa. Nestas técnicas, uma pequena quantidade de sorvente é imobilizado em suporte sólido (dispositivo SPME), que é exposto à amostra, sendo a extração baseada no equilíbrio de partição dos analitos entre a amostra e o sorvente. Nesta tese diferentes fases biocompatíveis foram desenvolvidas para uso em SPME associado a GC ou LC, com ênfase na determinação de biomarcadores de doenças neurodegenerativas em amostras biológicas. No Capítulo 1, os fundamentos teóricos da SPME foram apresentados, assim como as definições de biomarcadores. No capítulo 2 o desenvolvimento de novos dispositivos SPME biocompatíveis revestidos com nanotubos de carbono (CNTs) combinados com polibenzimidazol (PBI) foi apresentado. Estes dispositivos SPME apresentaram alta estabilidade mecânica, química e térmica em análises LC-MS e/ou GC-MS. Na análise de benzeno, tolueno, etilbenzeno e o-xileno, o revestimento CNT-PBI inovador, quando comparado aos revestimentods de carboxen-polidimetilsiloxano (CAR-PDMS) e de CAR-PBI, apresentou melhor performance, considerando a eficiência da extração. Nas análises de drogas de abuso não polares por LC-MS, o revestimento CNT-PBI apresentou extrações mais eficientes quando comparado ao revestimento preparado com o binder convencional poliacrilonitrila (CNT-PAN), além de obter performance comparável ao revestimento de C18-PAN. Nas análises untargeted de amostras de água utilizando lâminas revestidas com CNT-PBI e CNT-PAN, os binders (PBI e PAN) demonstraram influência significativa na capacidade de extração dos materiais. No Capítulo 3 foi apresentado o desenvolvimento de um capilar com nova fase monolítica orgânica de troca aniônica de acesso restrito, utilizado como dispositivo de extração para in-tube SPME, para a determinação de homocisteína (Hcy) e ácido homocisteico (HCA), potenciais biomarcadores da DA, em amostras de liquido cefalorraquidiano (LCR). A fase desenvolvida apresentou extração seletiva dos analitos e exclusão simultânea de cerca de 90 % das macromoléculas (proteínas) da matriz. A otimização dos parâmetros da in-tube SPME favoreceram a eficiência de extração. O método proposto apresentou faixa de linearidade de 8 a 250 ng mL-1 para Hcy e de 5 a 150 ng mL-1 para HCA, com adequados valores de precisão e exatidão, além de efeito matriz não significativo. Este método foi aplicado em estudo clínico para análises de amostras de LCR de pacientes com a DA, com comprometimento cognitivo leve (CCL) e de voluntários do grupo controle. Foi observado um aumento significativo nas concentrações de Hcy nos grupos AD (p = 0,0487) e CCL (p = 0,0022) em comparação ao grupo controle, demonstrando o potencial desse analito como biomarcador da DA. No capítulo 4, o método in vivo SPME, com fibras biocompatíveis revestidas com partículas de balanço hidrofílico-lipofílico (HLB-PAN, 5 mm, 12 µm) foi desenvolvido para a determinação dos endocanabinóides anandamida (AEA) e 2-araquidonoilglicerol (2-AG) em encéfalo de ratos. A extração foi realizada em condições de depleção negligenciável, fazendo uso de volume reduzido de fase extratora, de modo a possibilitar a determinação quantitativa das concentrações livres e totais dos analitos. O tempo de equilíbrio foi definido como 15 minutos para ambos os analitos. Para as determinações das concentrações livres foram determinados os coeficientes de distribuição (Kfs) dos analitos, com valores iguais a 10500 e 7300 para AEA e 2-AG, respectivamente. Para determinação das concentrações totais, foi determinada a porcentagem de ligação dos analitos à matriz (MB %), sendo igual a 99% para ambos. O método in vivo SPME foi aplicado com êxito na determinação das concentrações de AEA, na região do estriado, em um modelo animal da DP, revelando um aumento significativo das concentrações de AEA nos animais parkinsonianos em relação aos animais controle, com concentrações livres iguais a 0,57 ng mL-1 e 0,45 ng mL-1, respectivamente.