Estudos moleculares das enzimas envolvidas na biossíntese de selenocisteína em Trypanosoma brucei e Leishmania major

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Elisandra Márcia Rodrigues
• Orientador(a): Otavio Henrique Thiemann
• Banca de defesa: Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo, Paulo Inácio da Costa, Ricardo De Marco, Ariel Mariano Silber
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade de São Paulo
• Programa de Pós-Graduação: Física
• País: BR
• Link de acesso: https://doi.org/10.11606/T.76.2008.tde-05092008-090707

Umas das principais formas biológicas de incorporação do selênio é na forma de um aminoácido denominado selenocisteína (Sec, U), que é incorporado co-traducionalmente ao polipeptídio nascente em posições específicas do códon UGA, que normalmente é reconhecido como códon de parada. A incorporação de selenocisteína em E. coli já está completamente esclarecida, com a participação dos genes que codifica para selenocisteína sintase (SELA), seril-tRNA sintetase (SerRS), um tRNASec específico (SELC), selenofosfato sintetase (SELD) e um fator de elongação próprio (SELB). Entretanto em eucariotos não há homólogos para SELA e existem evidências de haver a necessidade de dois passos enzimáticos que substituem a atividade desempenhada por SELA, com uma fosforilação da serina seguida de uma selenilação através das enzimas Fosfo-Seril-tRNASec Kinase (PSTK) e Sep-tRNA:Sec-tRNA sintase (SepSecS), respectivamente. A via de biossíntese e incorporação de selenocisteína é muito estudada em alguns organismos, mas ainda pouco explorada em Kinetoplastida. Nesse sentido, realizaram-se estudos moleculares das enzimas envolvidas nessa via, mais especificamente em Trypanosoma brucei e Leishmania major. Foram identificados o elemento SECIS na região 3´ do mRNA que atua no reconhecimento do códon UGA interno e, em fase de leitura na inserção de selenocisteína em Leishmania major e Leishmania infantum; a incorporação de Se75 em proteínas de Leishmania; a ocorrência do tRNASec em Trypanosoma e Leishmania e, adicionalmente todos os genes necessários para a síntese de selenocisteína: SELB, SELD, PSTK e SECp43. Foram obtidos clones dos genes selB e selD em vetor de expressão pET28a(+) e as proteínas foram expressas em bactérias Escherichia coli cepa BL21 (DE3). A proteína recombinante SELD foi purificada em cromatografia de afinidade e seu pI e massa molecular foram determinados usando as técnicas de sistema Phast de eletroforese e gel nativo. As proteínas SELB, SELD, SECp43 e Seril tRNA sintetase foram imunolocalizadas no citoplasma de células nativas de T. brucei. Uma nova metodologia \"PTP tagging\" foi utilizada para estudos de interação protéica com uso de proteínas alvos SECp43, SELB e PSTK na busca de novas proteínas ligantes na via de selenocisteínas em T. brucei. Futuras investigações moleculares e estruturais das enzimas envolvidas na via de selenocisteína em Kinetoplastida poderão trazer informações relevantes no entendimento da biossíntese desse aminoácido, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos visando o tratamento de doenças causadas pelos parasitas Trypanosoma brucei e Leishmania major.