Importância do resíduo N-terminal da bradicinina e dos sítios extracelulares do receptor B2 de cininas na ligação e ativação: estudo com mutantes e análogos da bradicinina

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Silva, Rafael Filippelli da [UNIFESP]
• Orientador(a): Shimuta, Suma Imura [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/0013000027q8m
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Receptor B2 da Bradicinina; Bradicinina; Proteínas Mutantes; Cálcio
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23227

Objetivos: Reavaliar o papel da arginina N-terminal da bradicinina; determinar a potencia, eficacia e parametros de ligacao dos analogos Ala1BK, Gly1BK, Glu1BK e Lys1BK; obter os mutantes Glu196Ala e Asp268Ala; expressar estavelmente o receptor B2 de cininas e os mutantes B2-E196A e B2-D268A em celulas ovarianas de hamster chines; estudar as consequencias dessas mutacoes sobre a expressao funcional e sobre a ligacao com a BK, assim como com os analogos. Metodos: Os valores de potencia e a eficacia foram determinados atraves de registros de contracao isometrica em fundus de estomago de camundongos C57/Bl6, e por meio de ensaios de mobilizacao de Ca2+ intracelular. Os parametros de ligacao foram determinados atraves de ensaios de obindingo por competicao, por metodo fluorimetrico, usando o ligante BK marcado com Europium. Os mutantes foram gerados no vetor de expressao pcDNA3.1 V5-His, contendo o inserto do receptor B2, segundo instrucoes do protocolo QuickChange® II Site-Directed Mutagenesis e transfectados em celulas CHO seguindo o protocolo Lipofectamine 2000. Reacao em cadeia da polimerase em tempo real foi utilizada para determinacao dos niveis de expressao genica relativa dos receptores transfectados. Resultados: Em relacao ao receptor selvagem, o analogo Ala1BK foi o que sofreu a reducao mais drastica de potencia e afinidade de ligacao; a Gly1BK teve sua potencia e afinidade de ligacao pouco reduzida, porem sua eficacia foi marcadamente inferior a da BK; a Glu1BK nao apresentou valores de resposta detectaveis; a Lys1BK teve sua eficacia levemente reduzida, porem os outros parametros determinados foram severamente reduzidos. A mutacao E196A diminuiu em 2,1x a afinidade da BK; neste mutante, os analogos tiveram eficacia similar entre si, e a reducao nos valores de potencia e afinidade de ligacao foram atenuados quando comparados ao receptor selvagem. No mutante B2-D268A, os resultados obtidos com a BK quanto a eficacia, potencia e afinidade de ligacao foram 1,3x, 13,9x, e 14,8x reduzidos, respectivamente, em comparacao ao receptor nao mutado; nenhum dos analogos apresentou valores detectaveis de atividade neste mutante. Conclusoes: Os resultados nos permitem concluir que: o guanido grupo da Arg1 e essencial para a interacao com o receptor; a presenca de Ala1, Gly1 e Lys1 em substituicao a Arg1 induz reducao na potencia, eficacia e afinidade de ligacao; a Glu na posicao 1 da BK leva a perda na capacidade de ligacao e da atividade do peptideo; os analogos ativam especificamente o receptor B2 de cininas; os receptores foram expressos estavelmente e com niveis similares de expressao; a expressao do receptor B2 transfectado reproduz satisfatoriamente a expressao endogena do fundus de estomago; as mutacoes nao afetaram a atividade basal do receptor; a reducao dos valores farmacologicos e de ligacao dos analogos foi atenuada no mutante B2-E196A; a mutacao Asp268Ala afeta a eficacia e a potencia da BK, e impediu o obindingo dos analogos