Clonagem, expressão em células humanas HEK293 e caracterização de uma proteína recombinante multimérica correspondente ao domínio de ligação ao receptor da proteína Spike do SARS-CoV-2

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Lima, Verônica Aparecida de [UNIFESP]
• Orientador(a): Schenkman, Sergio [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• dARK ID: ark:/48912/001300001zrpq
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: SARS-CoV-2; COVID-19; Anticorpos neutralizantes; Proteína S; Domínio de ligação ao receptor
• Link de acesso: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/67264

A doença COVID-19 responsável pela pandemia causada pelo vírus SARS-CoV-2 deixou mais de 6,6 milhões de mortes no mundo. O vírus SARS-CoV-2 é um betacoronavírus que pertence a família coronaviridae, possui aproximadamente 80% de similaridade com SARS-CoV, 51,8% com MERS-CoV e aproximadamente 96,2% com SARS-CoV de morcego RaTG13. O SARS-CoV-2 possui quatro proteínas estruturais e dezesseis proteínas não estruturais. A proteína S é uma das proteínas estruturais exposta na sua superfície e é o principal alvo para produção de vacinas e de anticorpos neutralizantes por conter o domínio de ligação ao receptor (RBD) responsável pela entrada do vírus em células humanas. A proteína S forma no vírus um trímero que é capaz de se ligar enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) promovendo a internalização da partícula viral pela célula. A maioria dos estudos de interação da porção RBD com o receptor tem sido feita com o fragmento monomérico contendo esta porção. Neste estudo expressamos em células HEK293 de maneira constitutiva e estável uma proteína recombinante contendo uma sequência sinal de imunoglobulina, a porção RBD seguida de uma região indutora de trimerização do bacteriófago T4 e uma sequência de 6 histidinas. Neste trabalho descrevemos a expressão da proteína e sua liberação no sobrenadante das células HEK293. A proteína foi purificada por coluna de Ni-agarose e cromatografia de exclusão e apresentou uma massa molecular de 135 kDa com uma estrutura secundária semelhante ao RBD monomérico. Análise em eletroforese em gel de poliacrilamida e SDS com e sem redutores foram compatíveis com a existência da forma de uma proteína multimérica, apresentando-se como trímeros e hexâmero identificados após “crosslinking”. A proteína purificada foi reconhecida pelo receptor ACE2 e gerou anticorpos com altos títulos (1:10000) em camundongos com a capacidade de inibir a ligação de ACE2-biotinilada à subunidade S1 e neutralizar a entrada do vírus, principalmente da linhagem Wuhan em células. Estes resultados agregam ao arsenal de combate à COVID-19, um possível imunógeno ou antígeno para diagnóstico.