Mapeamento físico do cromossomo 2 e avaliação do papel do miniexon na virulência de Leishmania major

• Ano de defesa: 1998
• Autor(a) principal: Antoniazi, Simone Aparecida
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Não informado.
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-18032026-171154/

Como parte de um projeto geral para construir o mapa físico do genoma do parasito Leishmania major, este projeto teve como objetivo construir o mapa físico do cromossomo dois (da linhagem clonal LV-39) que contém o gene do miniexon. Este gene é repetido em tandem no genoma de todos os Tripanossomatídeos, sendo fundamental para o processamento de todo e qualquer RNA mensageiro (mRNA), através do mecanismo de \"trans-splicing\". O mapeamento físico do cromossomo permitiu localizar os clones genômicos que carregam o tandem do referido gene. Esta região foi então utilizada para realizar alguns estudos funcionais, através de transfecção. A amplificação gênica do arranjo do miniexon ocorre em algumas linhagens de Leishmania e já foi sugerido que esta amplificação poderia estar relacionada a uma vantagem de crescimento e exacerbação da virulência da linhagem do parasito (Iovannisci & Beverley, 1989. Mol. Biochem. Parasitol., 34:177-188). Para testar esta hipótese, um clone da região mapeada contendo 40 kb de miniexon (aproximadamente 100 cópias do gene), foi inserido numa linhagem clonal avirulenta de L. major (MHMO/IR/83/LT 252), utilizando-se a técnica de transfecção. Para verificar se esta manipulação alterou o perfil de crescimento ou o padrão de virulência dos clones transfectantes obtidos, avaliou-se o crescimento e o processo de metaciclogênese in vitro, para estes clones. Foi demonstrado que o processo de transfecção não influenciou o padrão de crescimento nem a metaciclogênese dos clones. Para avaliar o padrão de virulência, três clones transfectantes foram injetados, por via subcutânea em animais susceptíveis (BALB/c), em 5 experimentos independentes. A linhagem virulenta LV-39, a linhagem a virulenta CC1 e um clone transfectante contendo somente o vetor cL-HYG foram utilizados como controles. Os estudos foram realizados sob níveis mínimo (16µg/ml) e alto (40µg/ml) de higromicina B para verificar possíveis alterações no padrão de virulência in vivo. Sob estas condições somente um dos clones transfectantes mostrou aumento significante de virulência, quando comparado a linhagem parental avirulenta. Os níveis de RNA destes transfectantes foram determinados e o aumento no nível de expressão do miniexon foi evidente sob 40µg/ml de pressão por higromicina B. Para testar se este efeito está relacionado à presença das cópias extra de miniexon foram obtidos clones \"curados\" a partir dos transfectantes originais, através de um ensaio de diluição limitante. A ausência da molécula foi confirmada por hibridação em \"Southern Blot\" contendo os clones curados. Os experimentos in vivo com estes clones sugerem que a alteração de virulência não está relacionada à presença de um maior número de cópias do miniexon.