Os hormônios tireoidianos regulam diferencialmente a expressão de genes e função das mitocôndrias em tireoide e fígado de ratos

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Moreno, Ana Caroline Rippi
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Autocrine; Autócrino; Fígado; Hipotireoidismo; Hypothyroidism; Liver; Mitochondria; Mitocôndria; Thyroid; Thyrotoxicosis; Tireoide; Tireotoxicose
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-03102025-112540/

Os hormônios tireoidianos (HTs: T3 e T4) são essenciais para o crescimento, desenvolvimento e metabolismo, e seus receptores são expressos em todos os tecidos, incluindo a tireoide. Contudo, pouco se sabe sobre as ações autócrinas do T3. Realizamos a análise do transcriptoma de células tireoidianas PCCL3 mantidas na ausência e presença de T3, por meio de sequenciamento de nova geração (RNASeq), a qual revelou inúmeros genes diferencialmente expressos, dos quais selecionamos os envolvidos com a função mitocondrial. São eles: Mpc1, Ndufv2, Usmg5, Atp5h e Atp5i. A seleção desses genes se baseou no seu importante papel funcional e em estudos prévios realizados no fígado de ratos que demonstraram ser a mitocôndria um alvo dos HTs. O objetivo do presente estudo foi validar os dados obtidos no RNASeq e avaliar num modelo in vivo, se os mesmos resultados são reproduzidos na tireoide e se esses genes também seriam alvo dos HTs no fígado. Ainda pretendeu-se investigar as possíveis repercussões sobre a expressão das proteínas codificadas por esses genes e a função mitocondrial nesses dois tecidos. A caracterização da funcionalidade das células foi verificada com experimentos em células PCCL3 mantidas em condições de (1) Starving: 96 horas em meio sem TSH ou 72h em meio sem TSH + 24h com TSH; e (2) Iodo: 24 horas em meio HAMF12 ou 24 horas em meio HAMF12+Iodo10-3M. Células PCCL3 receberam meio no qual o SFB havia sido depletado de HTs, procedimento realizado por meio da passagem do soro em uma resina especifica (AG-501-X8-Resin), permanecendo nesse meio por 24h. Após 24h as células foram subdivididas em dois grupos: um deles foi submetido ao tratamento com T3 na concentração de 10-7 M por mais 24h (grupo T3), enquanto o outro foi mantido no meio com soro depletado de HTs (grupo Hipo), por mais 24h (totalizando 48h). Na sequência foi realizada a extração do mRNA e quantificação da sua expressão por RT-qPCR. Em paralelo, ratos Wistar com ±250g foram divididos aleatoriamente nos grupos: (1) Controle; (2) Hipotireoideo (Hipo), que recebeu Metimazol (MMI), 0,03%, dissolvido na água de beber e (3) Tireotoxicose (T3), que recebeu injeções ip de T3 na dose de 1,5 µg/100g de PC. Após duas semanas, os animais foram eutanasiados e foram coletados o sangue, para obtenção do soro, a tireoide, hipófise e fígado os quais foram armazenados em freezer a -80ºC. Foram avaliadas a concentração sérica de TSH (MILLIplex) e a expressão gênica (RT-qPCR) de Gh e bTsh na hipófise. Na tireoide e fígado foi realizada a análise da expressão dos genes diferencialmente expressos no RNAseq (RT-qPCR) e das proteínas que eles codificam (Western Blotting). Em ambos os tecidos foram analisados a atividade enzimática da citrato sintase (Espectrofotômetro Epoch), respiração mitocondrial (Oroboros) e conteúdo de outras proteínas da cadeia respiratória (NDUFV8, SDHB, CORE2, MTC01, ATP5A e CYCSC). Na tireoide o comprimento da cauda Poli-A dos genes identificados por RNASeq foram avaliados, assim como o conteúdo proteico de FAM103, envolvida na introdução do CAP na porção 5 do mRNA. No fígado, outras proteínas de função, fissão e fusão mitocondrial foram analisadas (UCP2, SOD1, NRF2, PINK1, OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1). Confirmamos a funcionalidade das células PCCL3 identificando aumento da expressão gênica de Nis após o estimulo com TSH, além de redução de Nis e Tpo após adição de Iodo. Na validação do RNASeq, todos os genes investigados apresentaram redução significativa da sua expressão (p<0.05), seguindo o padrão do RNASeq (redução no grupo Hipo vs T3). Não observamos alteração na expressão de nenhum dos genes diferencialmente expressos em RNASeq, após o tratamento com TSH. Em ratos, identificamos aumento da concentração sérica de TSH e da expressão gênica de bTsh em hipófise nos animais Hipo, assim como redução dos mesmos no grupo T3, confirmando a eficácia da intervenção. Notamos redução do consumo de ração, ganho de peso e da expressão gênica de Gh no grupo Hipo (vs Controle e T3), o que era esperado pela reconhecida taxa metabólica reduzida nessa condição. Na tireoide, todos os genes apresentaram conteúdo similar ao padrão do RNASeq, com redução na condição de hipotireoidismo, não detectando diferença estatística apenas o gene Atp5i. No entanto, a análise do conteúdo proteico revelou no grupo Hipo, aumento de ATP5I (vs T3) e ATP5H (vs T3 e Controle), sem correspondência com a redução detectada no mRNA dos respectivos genes, sugerindo na tireoide possíveis ações pós-transcricionais de modo a garantir a síntese dessas importantes proteínas dentro da normalidade. Não foi observado diferença na respiração mitocondrial na tireoide, porém detectamos redução da atividade da citrato sintase no grupo T3 (vs Controle e Hipo). Investigando ações pós transcricionais na tireoide, não detectamos diferença no comprimento da cauda poliA dos genes investigados, porém observamos aumento do conteúdo proteico de FAM103A1 no grupo Hipo em comparação aos demais, sugerindo aumento da estabilidade do mRNA pela adição do Cap na sua extremidade 5. No tecido hepático, observou-se redução apenas da expressão gênica de Mpc1 em animais Hipo (vs Controle e T3) e nos animais T3 (vs Controle), e de Ndufv2 nos animais Hipo (vs Controle). A expressão proteica seguiu o padrão da expressão gênica, ou seja, houve redução de NDUFV2 nos animais Hipo (vs T3). Foi observado também aumento da proteína ATP5I no grupo T3 (vs Controle e Hipo), sem alterações nas demais. No consumo de oxigênio, como esperado, observamos nos hepatócitos do grupo T3 aumento do estado 2 (vs Hipo), 3 (vs Hipo e Controle) e 4 (vs Hipo), com aumento na atividade da enzima citrato sintase (vs Controle e Hipo). No grupo Hipo, notamos redução do conteúdo proteico de CYCS (vs T3), e aumento do NRF2 (vs Controle e T3) e PINK1 (vs T3), sugerindo um efeito protetor do tecido nessa condição, visto que sob condições de estresse oxidativo, o NRF2 regula positivamente PINK1, que atua promovendo a mitofagia e revertendo os fenótipos de degeneração celular. As demais proteínas avaliadas não apresentaram diferença estatística. Nossos dados apontam para uma ação diferencial dos HTs nas mitocôndrias da tireoide em relação às do tecido hepático. Concluindo, o tratamento com T3, mesmo em doses 10 vezes menores que as habitualmente utilizadas para induzir tireotoxicose, promove aumento da massa mitocondrial, da termogênese e da síntese de ATP nos hepatócitos. Curiosamente, no grupo Hipo há um aumento na via de sinalização NRF2-PINK1, sugerindo uma estratégia adaptativa para a sobrevivência celular. Na tireoide, apesar do grupo Hipo apresentar redução da expressão dos genes de interesse, o conteúdo proteico dos mesmos encontra se elevado/similar ao controle, assim como o consumo de O2. Sugere-se um controle pós transcricional na condição de Hipo, possivelmente com a participação da proteína FAM103A1, que aumenta a t1/2 dos mRNAs de interesse, mantendo a taxa respiratória (pelo menos em curto prazo), o que seria desejável considerando a importância desta glândula para a fisiologia dos órgãos e sistemas.