Participação do inflamassoma de NLRP3 nas respostas ao estresse in vivo e in vitro: possíveis efeitos modulatórios do canabidiol

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Sato, Yurie
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CBD; Inflamassoma de NLRP3; Microglia; Micróglia; Neuroinflamação; Neuroinflammation; NLRP3 inflammasome
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-13012026-164522/

As limitações dos tratamentos atuais para os transtornos mentais relacionados ao estresse destacam a necessidade de compreender melhor os mecanismos patofisiológicos envolvidos, dando subsídio para a busca de novas terapias. Um alvo promissor nesse contexto é o inflamassoma de NLRP3, cuja ativação tem sido associada a diversos distúrbios neuropsiquiátricos. Nesse cenário, o canabidiol (CBD) é destacado devido a sua atividade neuroprotetora e anti-inflamatória, incluindo a modulação da ativação microglial e indução de autofagia, mecanismos potencialmente relacionados ao inflamassoma de NLRP3. Assim, usando modelos in silico, in vitro e in vivo, foi criada a hipótese que os efeitos do CBD em situações de estresse são, pelo menos em partes, mediados pela modulação da sinalização do inflamassoma de NLRP3. Nos experimentos in silico, por meio de docagem molecular, observou-se que o CBD apresenta alta afinidade de interação com as proteínas TLR4 e ASC. Nos experimentos in vivo, foi investigado se o estresse de choques inescapáveis nas patas (2 dias; 12 choques; 0,8 mA de intensidade; 10 segundos de duração; 10 segundos de intervalo) induziria alterações da expressão gênica de componentes do inflamassoma de NLRP3 por real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) de forma tempo-dependente em camundongos machos C57BL6. Além disso, investigou-se se o CBD (10 e 30 mg/kg, administrado imediatamente após cada uma das quatro reexposições ao contexto do estresse) atenuaria as consequências comportamentais tardias induzidas pelo estresse. Como resultados, o estresse aumentou a expressão gênica de ASC no córtex pré-frontal e P2X7 no hipocampo, 3 horas e 24 horas após o estressor, respectativamente. Comportamentalmente, o estresse induziu hipolocomoção pelo teste de campo aberto e formação de memória de medo que foi parcialmente extinta ao longo das reexposições. No entanto, a aplicação de um choque reminder (1 choque; 0,4 mA de intensidade; 2 segundos de duração) não reativou a memória aversiva, e o tratamento com CBD não promoveu alterações comportamentais. Nos experimentos in vitro, avaliou-se a viabilidade celular pelo método colorimétrico de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil brometo de tetrazoilium (MTT), a expressão proteica de iNOS, componentes do inflamassoma de NLRP3 e autofagia por western blotting (WB), formação de puncta da ASC por imunofluorescência, níveis de TNFα e IL1β por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) e atividade da caspase-1 por kit enzimático em células BV-2. Dessa forma, investigou-se a capacidade do tratamento com corticosterona (CORT; 50, 500 e 1000 nM; 24 horas) ou lipopolissacarídeo (LPS; 100 ng/mL; 4 horas) e adenosina trifosfato (ATP; 1 mM; 1 hora) de induzirem resposta inflamatória, e do tratamento CBD (0,1, 1 e 10 µM; 4 horas) realizado antes, entre e após os estímulos com LPS e ATP em prevenir ou atenuar esses efeitos. Os resultados mostraram que a CORT não modulou o inflamassoma de NLRP3, no entanto o tratamento com LPS e ATP aumentou TNFα, iNOS, NLRP3 e pró-IL1β, de forma que o pré-tratamento com CBD (10 µM) previniu o aumento de NLRP3 e pró-IL1β. Com isso, foi investigado se o pré-tratamento com CBD preveniria a formação de puncta da ASC induzido pelo LPS e ATP, no entanto todos os grupos experimentais apresentaram formação de puncta da ASC. Para investigar a participação da autofagia, o pré-tratamento com rapamicina (RAP; 50 nM; 4 horas) foi utilizado como controle positivo, além dos inibidores da da autofagia 3-metiladenina (3-MA; 5 mM; 1 hora) e bafilomicina (BAF; 100 nM; 1 hora) que foram utilizados antes do tratamento com CBD. Os resultados mostraram que a RAP mimetizou parcialmente o efeito antiinflamatório do CBD, reduzindo NLRP3 e pró-IL1β. No entanto, os efeitos do CBD foram mantidos mesmo na presença dos inibidores de autofagia sugerindo que sua ação não depende desse processo. Embora não tenham sido observadas mudanças comportamentais significativas nos modelos in vivo, os achados in vitro e in silico reforçam o potencial do CBD como modulador da neuroinflamação associada ao estresse.